李明杰，謝彩俠，古力，楊超飛，杜家方，王豐青*，張重義*

1.福建農林大學 農學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學 作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室，福建 福州 350002；3.河南中醫(yī)藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046；4.河南農業(yè)大學 農學院，河南 鄭州 450002

藥用植物與棲息地生境的相互作用是藥用植物次生代謝產物合成的重要原因。其中，光照是影響藥用植物生長發(fā)育、形態(tài)建成的核心生態(tài)因子，也是植物初生和次生代謝途徑的重要驅動因子。藥用植物所處生態(tài)區(qū)域的海拔、坡向、經緯度不同，其所受到光照輻射參數也存在明顯的差異。藥用植物在長期適應特定地區(qū)的光照尺度變化過程中，逐漸的適應并固化這些光照特質，形成了不同光照需求度和喜光特性以及特定外形[1]。因此，光照條件對于特定生態(tài)區(qū)中外源遷徙和馴化植物的成功生存起著極其重要的作用，是決定植物能否成功馴化并進化的重要決定性因素之一[2]。因此，光照也成為藥用植物道地性形成過程中最為重要的生境支配因素之一。目前，光照強度對陰生藥用植物影響的研究相對較多，但大部分研究集中在最適光強、光質的篩選以及光照對藥用植物活性成分誘導性效應；但光照是如何調控藥用植物發(fā)育和影響藥用植物次生代謝合成的，其具體機制尚不清晰。

地黃RehmanniaglutinosaL.是玄參科植物，以塊根入藥，始載于《神農本草經》，被列為上品，為常用大宗藥材。地黃藥材味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經，功用清熱生津、涼血、止血。道地產區(qū)為古“懷慶府”，即今河南焦作地區(qū)，包括溫縣、武陟、博愛、沁陽等沁河兩岸部分縣區(qū)[3-4]。目前，在道地產區(qū)常年都有很大的種植面積，產值達數十億元。在非道地產區(qū)山西、山東、河北也有較大的種植面積，甘肅、黑龍江等省份也有種植。地黃是典型的喜光藥用植物之一，合適的光照強度對于地黃植株的形態(tài)建成、塊根發(fā)育和藥用成分合成起著極其重要的作用。在地黃的栽培生產實踐中，充足的光照是保證地黃產量和品質的重要前提條件之一。前期研究發(fā)現地黃葉片和根組織中均含有毛蕊花糖苷、梓醇等地黃的代表性藥用活性成分，而遮陰則能顯著影響地黃的葉片發(fā)育，同時，導致其中毛蕊花糖苷的含量降低，遮陰程度越高其降低幅度越大[3]。為了進一步詳細探究光照強度與地黃葉片發(fā)育和次生代謝產物的累積機制間的關聯性，本研究以地黃作為研究材料，通過遮陰的方法人為模擬出不同光照強度條件，探究不同光照強度對地黃生長發(fā)育的影響；同時，用轉錄組測序技術(RNA-Seq)解析不同光照強度對地黃轉錄水平的擾動效應，從分子水平上探究光照強度對地黃葉片發(fā)育及內在代謝機制的影響。以期為闡明光照因子對藥用植物代謝積累機制奠定基礎，同時，也為道地藥材的形成機制和建立合理的耕作制度研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與遮陰處理

選用地黃品種“溫85-5”作為遮陰處理對象，經河南中醫(yī)藥研究院張留記研究員鑒定，所用實驗材料為R.glutinosaL.。受試地黃“種栽”播種于河南農業(yè)大學農場隔離實驗田內，生長發(fā)育期間的栽培管理措施與大田生產保持嚴格一致。在地黃出苗30 d后，利用不同透光水平的遮陰網進行梯度遮陰處理。具體操作方法如下：設置3個處理組，每組處理選擇80～100株地黃苗。在地黃出苗后30 d左右，保留1組地黃在正常光照下進行生長(全光照)，剩余2組地黃則分別進行60%和90%的遮光處理，3組處理平行進行實驗。所有處理分別在遮陰處理后的30、60、150 d取樣，每處理隨機取10株長勢一致植株，詳細統計其葉長、葉寬及葉片數等葉部關鍵參數。選取不同處理下30 d的葉組織制備石蠟切片，詳細觀察其組織結構的差異，同時，將90%遮陰及全光照樣品用液氮凍存，進行下游的RNA-Seq轉錄組測序，獲取遮陰處理下葉內的關鍵分子響應進程。

1.2 RNA-Seq及分析

用TRIzol法提取不同遮陰處理地黃葉的總RNA，利用DNase I去除樣品總RNA中殘存DNA片段。然后，利用嵌有Oligo(dT)接頭的磁珠對樣品中的mRNA進行富集。對富集出的mRNA進行片段化處理，并以這些碎片化的mRNA為擴增模板，反轉錄為cDNA。cDNA樣品在經過末端修復、測序接頭添加、特定片段切膠回收、多輪擴增及純化等一系列步驟后，完成測序文庫的制備。利用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System對所已經構建的測序文庫的質量和產量進行評測，將經過質控檢測的文庫進行高通量測序(華大基因)，選用Ion Proton平臺進行測序。

對測序所獲取的原始數據(raw reads)進行質控處理，過濾掉其中低質量、接頭等污染序列，獲取clean reads序列。將clean reads與地黃參考序列庫進行比對，統計不同樣品的reads比對率以及分布，進一步評估不同樣品所獲取的reads序列中外源序列污染水平。在此基礎上，根際地黃參考序列中reads匹配數來計算不同樣品轉錄本的表達水平，表達量用FPKM表示。對比分析遮陰前后地黃葉片中轉錄本的表達水平，獲取響應遮陰處理的特異響應基因，并對其進行GO和KEGG富集分析，獲取遮陰處理下地黃葉片內關鍵分子響應進程。

1.3 實時熒光定量PCR

提取不同處理葉片的總RNA，利用反轉錄試劑盒(TaKaRa，大連)進行cDNA第一鏈合成。反轉錄體系：<2 μg總RNA，1 μL oligo dT Primer(50 μmol·L-1)，0.5 μL RNAase Inhibitor(40 U·μL-1)，1 μL dNTP Mixture，4 μL 5×PrimeScript Ⅱ Buffer，1 μL的PrimeScript Ⅱ RTase(200 U·μL-1)，加ddH2O補充至20 μL。在42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min的條件下進行反轉錄。以不同差異基因的編碼區(qū)序列為模板設計qPCR引物(見表1)，選用RgTIP41基因作為內參。利用SYBRPremix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (Takara，大連)熒光實時定量PCR試劑盒對不同基因的表達量進行分析。qPCR采用25 μL反應體系，包括2 μL上述反轉錄cDNA，1 μL上游引物(10 μmol·L-1)，1 μL下游引物(10 μmol·L-1)，12.5 μL SYBRPremix ExTaq，8.5 μL ddH2O。具體反應程序設置：95 ℃下30 s；95 ℃下5 s，60 ℃下30 s，循環(huán)數40。反應結束后，導出不同樣品的擴增Ct循環(huán)數，利用2-ΔΔCt法來計算不同轉錄本的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 遮陰對地黃葉片的表型和組織解構的影響

為了詳細了解不同光照強度對地黃葉片生長和發(fā)育影響，在大田條件下，在其他因素不變情況下，分別用60%、90%的遮陰網對地黃進行人為的遮陰處理。結果發(fā)現，遮陰后地黃的生長受到明顯的影響。遮陰后地黃葉片變平展，葉色由黃綠變深綠(見圖1A)。葉片上的泡狀凸起減少或變小，且隨著遮陰程度的增加而消失(見圖1A)。葉片變薄，葉肉柵欄組織和海綿組織細胞減少、變小(見圖1B)。遮陰30 d后，2種遮陰葉片大小與對照相差不多，但葉片數量減少；遮陰60 d時，90%遮陰的葉片長度、寬度和葉片數均顯著低于60%遮陰和未遮陰對照；150 d時，60%和90%遮陰的葉片長度、寬度和葉片數均顯著低于未遮陰對照(見圖1C)。說明遮陰對地黃地黃部葉片的生長有著顯著的影響，且隨著遮陰程度的增加和遮陰時間的延長表型變化更加明顯。

表1 用于確認RNA-Seq差異表達基因準確性的qPCR引物

注：A.遮陰對地黃葉片泡狀凸起的影響；B.遮陰對地黃葉片解剖結構的影響；C.遮陰對地黃葉片長度、寬度和葉片數的影響。圖1 遮陰對地黃葉片生長的影響

2.2 遮陰對地黃葉內的關鍵細胞進程的影響

為了深入解析遮陰處理對地黃葉片內在分子進程的影響，選取對地黃葉片表型和組織解構具有明顯影響的90%遮陰處理，通過RNA-Seq技術詳細分析其與正常葉片間的響應基因差異。結果在全光照地黃、90%遮陰的地黃的葉中分別獲取了11 865 182和10 606 388個clean reads(見表2)。將這些序列與前期已經構建的地黃轉錄組庫進行比對，發(fā)現全光照和遮陰處理葉中分別有98.99%和98.91%的clean reads可以匹配到轉錄組上，其中，特異匹配的序列分別占到總序列的76.00%和75.32%。從2個樣品的reads匹配率可以明顯看出，2個樣品中所產生的clean reads，有98%以上的序列可以匹配到地黃轉錄組，說明2個樣品的測序質量均達到了較高水平，可以進行下游的定量分析。

為了進一步獲取遮陰處理和正常光照間的差異響應基因，分別將遮陰處理樣品和對照樣品的基因進行定量，同時，進行差異顯著性分析。結果發(fā)現有2393個基因在90%遮陰處理和對照間出現差異表達，其中，有1456個基因在遮陰處理后葉內顯著上調，有937個下調(見圖2)。為了確證這些通

表2 遮陰處理地黃和對照地黃葉片RNA-seq測序結果統計

注：A.遮陰處理地黃與正常光照處理地黃間顯著差異表達基因分析；B.遮陰處理地黃與正常光照處理間顯著差異表達基因數量。圖2 遮陰處理與正常光照(全光照)地黃葉片間顯著差異表達基因的鑒定與篩選

過數字基因表達分析所獲取差異基因的準確性，從上述顯著差異表達的基因中挑選RgWRKY(CL4160.Contig2)、RgBRI-KI(CL4599.Contig2)、RgA-AAR(CL3002.Contig2)、RgERF(Unigene2558)、RgMYB(Unigene21429)、RgEXPA8(Unigene10535)、RgEXPA1(Unigene13756)和RgCAD(CL379.Contig1)等8個基因，利用 qRT-PCR方法對其進行定量。結果發(fā)現qRT-PCR 與通過數字基因表達譜分析中所獲取的上、下調基因的差異表達趨勢基本一致，相關系數達到 0.936(見圖3)，這表明本研究通過數字基因表達譜方法所鑒定差異基因是較為可靠性的。

圖3 RNA-seq數據與qRT-PCR結果的相關性分析

2.3 地黃葉片中響應遮陰處理關鍵基因的功能分析

為了解析遮陰處理下地黃葉片中關鍵表達基因功能，將已經獲取差異表達基因進行GO和KEGG功能注釋。GO功能分類主要從分子功能(molecularfunction)、細胞位置(cellular component)、生物進程(biological process)3個層級上來描述相應基因的功能。詳細分析遮陰處理和對照間差異基因的GO的功能分類發(fā)現：在生物進程分類中有22個GO條目匹配了相應差異基因，其中，細胞代謝進程(metabolic process)和細胞進程(cellular process)條目中所包含的基因數量最多，而細胞節(jié)律(rhythmic process)和細胞殺傷性(cell killing)條目中基因最少。在細胞位置分類中，共有11類GO條目匹配了相應基因，其中，細胞(cell)、細胞部位(cell part)2個條目中所匹配的基因數量相對較多，細胞器(organelle)條目中較少，細胞連接(cell junction)、胞外區(qū)部位條目中所占基因數量最少。此外，在分子功能分類中，共有10類GO條目匹配了相應基因，其中，催化劑活性(catalytic activity)、結合(binding)條目所匹配的基因最多，其次為轉運活性(transporter activity)，其它7類GO條目所匹配基因總數均在50以下(見圖4)。上述結果表明遮陰處理影響了地黃葉內的多重細胞進程。

同時，為進一步深入解析遮陰處理內葉片差異響應基因功能，利用KEGG數據庫對所獲取的差異基因所涉及的代謝通路進行分析。結果發(fā)現遮陰處理與對照間有 1278個差異表達基因可以富集歸類到120個代謝進程中，占總差異基因的53.4%，有23個

圖4 遮陰后地黃葉片中差異表達的基因GO分類

代謝通路達到了顯著富集水平(P<0.05)(見表3)。其中，有139個差異基因在真菌和植物互作進程中(Plant-pathogen interaction)顯著富集，占到總差異基因的10.88%，這側面反應了遮陰可能引發(fā)了植物葉片內應激逆境響應。有104個差異表達基因在植物激素信號轉導(Plant hormone signal transduction)通路中顯著富集，這說明遮陰處理擾動了地黃葉片中正常激素信號系統響應，間接影響了葉片的正常生長發(fā)育。有59個差異表達基因在苯乙醇苷類物質生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)通路也被顯著富集，這表明遮陰處理可能影響了地黃葉片中次生代謝產物的正常合成。此外，值得注意的是，與淀粉與蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、類胡蘿卜素生物合成(Carotenoid biosynthesis)、黃酮類物質的生物合成(Flavonoid biosynthesis)、單萜類物質的生物合成(Monoterpenoid biosynthesis)以及倍半萜和三萜類物質的生物合成(Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis)等初生、次生代謝進程密切關聯的通路中也顯著富集了大量差異表達基因，這表明遮陰處理顯著影響了地黃初生代謝以及次生代謝產物正常合成進程，從而間接的影響了地黃葉內干物質的積累以及關鍵藥用活性成分的累積?？傊?，通過遮陰處理下關鍵差異基因的功能途徑的初步解析，為進一步了解地黃葉片生長發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝產物積累的分子調控機制研究提供了關鍵參考信息。

表3 遮陰處理后差異基因富集的前25個代謝通路

2.4 地黃葉片中響應遮陰處理關鍵分子事件

2.4.1遮陰處理干擾了光合通路關鍵基因的表達 分析遮陰后地黃葉片中參與光合作用相關基因表達情況，發(fā)現參與光合通路(Photosynthesis)的11個基因均在遮陰后下調表達(見表4)。這些基因主要包括光系統I的P700 葉綠體a脫輔基蛋白A2基因psaA和亞基Ⅷ基因psaI，光系統II的反應中心D1蛋白基因PsbA和13 kDa蛋白基因Psb28，細胞色素b6/f復合體的脫細胞色素f基因petA，以及F-ATP酶α基因、β基因和a亞基基因。

2.4.2遮陰處理影響了葉片中關鍵激素代謝和關鍵信號通路 在遮陰地黃葉片差異基因富集的KEGG信號通路中，植物激素信號通路顯著被富集(見表5)。鑒定出生長素信號通路中AUX1基因、AUX/IAA蛋白基因、生長素響應蛋白ARF基因和生長素應答GH3基因等17個多數差異表達的基因，在遮陰后的地黃葉片中14個基因上調表達，僅有3個下調表達。在細胞分裂素信號通路中，細胞分裂素受體蛋白基因CRE1、 B型ARR蛋白基因上調表達，A型ARR蛋白基因下調表達，說明遮陰后葉片細胞的分化受了影響。在赤霉素信號通路中，有10個DELLA蛋白基因均呈下調表達。乙烯信號通路中，1個乙烯受體蛋白基因ETR下調表達，而5個蘇氨酸蛋白激酶基因CTR1均呈上調表達。這些結果表明遮陰處理改變了葉片內關鍵激素信號系統調節(jié)功能，這種變化更多的體現了葉片在弱光環(huán)境下適應性調節(jié)變化。

表4 RNA-Seq分析鑒定的光合系統相關的差異表達基因

表5 RNA-Seq分析鑒定的激素調控相關的差異表達基因

續(xù)表5

2.4.3遮陰處理抑制了梓醇和毛蕊花糖苷合成通路中關鍵催化酶基因的表達 梓醇和毛蕊花糖苷是地黃植株中標志性藥用活性成分，為了解析遮陰對地黃葉片中2種關鍵藥用活性成分的影響，對遮陰處理下梓醇和毛蕊花糖苷代謝通路中關鍵催化酶基因的表達變化進行了詳細分析。結果發(fā)現鑒定出12個差異表達的催化酶基因涉及梓醇合成，其中11個下調表達，僅有1個基因上調表達(見表6)。在下調表達的關鍵基因中，包括1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、4-羥基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸還原酶(HDR)和異戊二烯基二磷酸δ-異構酶(IPI)等萜類成分合成的骨干催化酶。此外，梓醇合成通路中的關鍵酶異戊二烯合酶(GES)、8-羥基香葉醇脫氫酶(10HGO)和鯊烯單加氧酶(SQM)在遮陰也呈現顯著下調。這些與梓醇、毛蕊花糖苷合成密切相關催化酶基因的下調表達，暗示著遮陰對萜類成分的積累可能具有明顯的抑制作用。

對毛蕊花糖苷合成通路中的關鍵催化酶基因在遮陰后的表達變化進行分析，發(fā)現有10個基因出現顯著差異表達(見表7)。其中，2個苯丙氨酸解氨酶基因PAL在遮陰后顯著上調表達，5個4-香豆素-CoA連接酶基因4CL中有4個則在遮陰后下調表達。在酪氨酸途徑中，有3個多酚氧化酶PPO基因，2個在遮陰后上調表達，1個下調表達。這些下調表達的關鍵催化酶基因可能在地黃毛蕊花糖苷的合成和積累中起著重要作用。

表6 通過RNA-seq分析鑒定到的參與梓醇合成的差異表達基因

表7 通過RNA-seq分析鑒定到的參與毛蕊花糖苷合成的差異表達基因

3 討論

光照強度主要通過光周期、光強(光密度)和光質影響藥用植物的生長發(fā)育進程和活性成分合成。如：許翔鴻等[5]在延胡索栽培中發(fā)現適當遮蔭可顯著提高其生物堿含量；向紅等[6]發(fā)現不同光照強度顯著影響當歸產量及阿魏酸含量。因此，在藥用植物栽培生產中，需根據藥用植物典型的需光特性，人為配置合適光照強度(光配方)以提高其產量和藥用品質。如：典型的喜陰藥用植物三七，適當遮蔭是其生產中必須考慮栽培措施[7]；金線蓮是典型的林下陰生藥用植物，生產中需要選擇具有合適郁閉度的林下環(huán)境種植[8]。喜光植物具有較高的光飽和點，全生育期都需要充足的光照，若生長季節(jié)中光照不足，則會使植物生長發(fā)育受到不同程度的影響。如：光照強度不足會降低高山紅景天根的生物量和紅景天苷的含量[9]；在曼陀羅及紫花曼陀羅植株中，隨著光照強度的增強，其莖內的花色素苷、類黃酮以及總酚等次生代謝產物的積累量也會相應增加[10]。耐陰植物的光飽和點較低，在較低的光照強度下即可達到光飽和點，弱光下比強光下生長好。低光照強度有利于石斛株高和可溶性蛋白含量的增加[11]。光照強度不僅能夠顯著改變葉片中關鍵藥用活性成分含量，對藥用植物葉片形態(tài)、生理和解剖結構也有顯著的影響[12]。如：遮陰使芍藥的光合能力變差，花鮮質量降低[13]；遮陰會使白三葉的光合速率降低，柵欄組織厚度變小，葉片變薄[14]。本研究發(fā)現，遮陰后地黃的葉片變薄，葉肉細胞海綿組織和柵欄組織厚度均降低，葉片數減少，葉片泡狀凸起程度變弱甚至消失，說明遮陰嚴重影響了地黃的葉片生長和分化。但光照是如何調控地黃葉片發(fā)育及其內在藥用成分合成機制目前并不清晰。

隨著高通量測序技術的快速發(fā)展，遮陰對植物發(fā)育調控的分子機制研究已經受到科研人員的關注。如：在玉米中，通過轉錄組分析就發(fā)現，遮陰能顯著影響葉片內光合作用、激素代謝相關基因的表達，其中，光合相關基因表達下調，而生長素、赤霉素代謝相關基因的表達上調，茉莉酸合成相關的基因則表達下降[15]。本研究中，在遮陰處理地黃葉內所有參與光合的基因均下調表達，說明遮陰下地黃光合能力不足可能是地黃生長不良的主要原因。同時，在遮陰地黃葉片中，與生長素信號轉導密切關聯的表達基因則顯著上調表達，這表明在遮陰處理下地黃通過提高生長素早期應答基因AUX1、AUX/IAA、ARF、CH3的表達來應對遮陰脅迫。DELLA蛋白是赤霉素信號通路的關鍵調控因子，DELLA下調表達可降低植物對GA的敏感性，加速植物莖的伸長[16-17]。遮陰處理地黃體內DELLA下調表達，與地黃莖伸長增加變化趨勢一致，說明遮陰后通過降低DELLA的表達降低地黃對GA的敏感性。乙烯信號通路中，乙烯受體蛋白基因ETR下調表達，而CTR1上調表達，說明地黃通過降低ETR表達，并提高CTR1表達來抑制下游的乙烯響應，以提升葉片對遮陰的適應。

葉片除了是重要的光合器官外，也是藥用植物次生代謝產物產生和貯藏的重要組織或藥用部位，前期的研究已經發(fā)現地黃葉片也含量有大量梓醇、毛蕊花糖苷等關鍵藥用活性成分。因此，藥用植物葉片為研究光照與藥用成分互作機制提供了良好基礎材料。光照強度還會影響藥用植物次生代謝產物的積累。如：強光有利于喜光藥用植物高山紅景天景天苷的積累[9]，也有利于曼陀羅莖花色素苷、類黃酮及總酚的積累[10]，但不利于耐陰藥用植物石斛可溶性蛋白的積累[11]。遮陰后，葡萄皮中的花色苷含量降低，參與花色苷合成的催化酶基因表達量也顯著降低[18]。梓醇和毛蕊花糖苷在地黃塊根和葉片中均有較高的含量，是《中華人民共和國藥典》中地黃質量控制的指標性成分。本研究發(fā)現參與梓醇生物合成的絕大多數催化酶基因在遮陰后呈下調表達，尤其是催化梓醇合成最后一步反應的鯊烯單加氧酶基因SQM表達量下調，與遮陰后梓醇含量下降的變化趨勢一致。本課題組前期完善了毛蕊花糖苷生物合成的代謝通路，克隆了部分催化酶基因[19-20]。這些催化酶基因中有10個在遮陰處理后出現顯著差異表達，有4個4-香豆素輔酶A連接酶基因和1個多酚氧化酶基因下調表達，表明遮陰同時也影響了毛蕊花糖苷的 代謝，但這種影響作用可能更為復雜?？傊狙芯砍醪浇沂玖斯庹湛赡芡ㄟ^生長素、乙烯等激素響應調控了葉片的耐陰適應性，同時，光照強度影響了梓醇等地黃關鍵藥用成分關鍵催化酶基因的轉錄變化，本研究為進一步揭示地黃光照強度響應機制和藥用成分合成機制提供了基礎數據。