吳梅青，羅栩強，唐海飛，陳思，顏濤

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學院，湖南 湘潭 411102；2.中山市仙逸堂中藥飲片有限公司，廣東 中山 528436

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Bench.的干燥近成熟果實，辛、苦，熱；歸肝、脾、胃、腎經(jīng)，具有散寒止痛、降溫止嘔、助陽止瀉的功效[1]，臨床主要用于治療寒凝疼痛、胃寒嘔吐、虛寒泄瀉等。吳茱萸入藥均是炮制品，有效的炮制方法是保證吳茱萸藥用功效、降低毒性成分的重要措施。吳茱萸的炮制方法很多，有湯洗、炒、酒炒、醋炒、鹽水炒、童便制、黃連制、黑豆汁制等[2]?，F(xiàn)行的炮制方法有酒制、醋制、鹽制、姜制、黃連制、甘草制等方法，收錄于各省、地區(qū)炮制規(guī)范中，如2015年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)收錄了吳茱萸甘草制法，《貴州省中藥飲片炮制規(guī)范》收錄了姜制、鹽制的方法[3]，《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》(2015年版)收錄了炒制、鹽制、醋制、黃連制的方法。生吳茱萸有小毒，多外用，長于祛寒燥濕，用于口瘡、牙痛、濕疹；甘草制后降低毒性，緩和燥性，可供內(nèi)服，用于寒疝腹痛、寒濕腳氣、厥陰頭痛、脘腹脹痛、經(jīng)行腹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等；鹽制吳茱萸能增強人腎的作用，宜用于疝氣疼痛[4-5]；醋吳茱萸能疏肝鎮(zhèn)痛，姜吳茱萸能散寒止嘔，酒吳茱萸治心腹氣滯作痛等[6]。吳茱萸所含化學成分復雜，主要包括生物堿類、黃酮類、萜類、酚類以及揮發(fā)油等[7]。吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素是吳茱萸主要藥效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓形成、調(diào)節(jié)體溫、保護心臟、抗阿爾茨海默病、抗腫瘤等藥理作用，可以作為吳茱萸藥材質(zhì)量控制的主要指標成分[8]。有文獻報道[9]，吳茱萸及其炮制品中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素成分含量有變化，會對臨床用藥效果產(chǎn)生影響。本研究選取了5個產(chǎn)地不同吳茱萸藥材，并按法定標準方法炮制同一產(chǎn)地吳茱萸藥材，得到甘草制、姜制、鹽制、醋制吳茱萸，并采用HPLC同時測定不同炮制品中指標成分含量的變化，為優(yōu)化吳茱萸炮制工藝及不同炮制品在臨床的應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津LC-16L)及工作站，島津SPD-16紫外可見檢測器，島津C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；十萬分之一分析天平(賽多利斯BP211D)；KQ3200DB數(shù)控超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；XL-600B多功能粉碎機(永康市小寶電器有限公司)。

1.2 試藥

吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素對照品(批號分別為：110802-201409、110801-201608、110800-201406)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙醇、乙腈為色譜純；自制超純水；四氫呋喃、磷酸均為分析純。

吳茱萸藥材分別購自于湖南邵東廉橋藥材市場，產(chǎn)地分別為湖南岳陽、瀏陽、湘鄉(xiāng)，貴州銅仁，湖南新晃等地。經(jīng)中山市仙逸堂中藥飲片有限公司羅栩強藥師鑒定為吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Bench.的干燥近成熟果實；吳茱萸炮制品均由對應(yīng)產(chǎn)地同一批吳茱萸藥材按法定標準方法炮制而得；甘草購自于湖南邵東廉橋藥材市場，經(jīng)中山市仙逸堂中藥飲片有限公司羅栩強藥師鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

2 方法和結(jié)果

2.1 吳茱萸炮制品的制備

2.1.1吳茱萸 取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，干燥。

2.1.2甘草制吳茱萸 參照《中國藥典》(2015年版)甘草制吳茱萸的方法[1]：取3 g甘草搗碎，加適量水，煎湯，去渣，加入50 g凈吳茱萸，悶潤吸盡后，炒制微干，取出，干燥，即得甘草制品。3份平行樣。

2.1.3姜制吳茱萸 參考相關(guān)文獻[9]：取 50 g生藥(3份平行樣)，藥材與干姜用量比100∶7.5，悶潤2 h，炒制溫度150 ℃下炒制8 min，即得姜制品。3份平行樣。

2.1.4鹽制吳茱萸 按照 2015年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》中鹽吳茱萸制法和《中國藥典》2015年版四部鹽灸法(炮制通則0213)：取 50 g生藥(3份平行樣)，加適量鹽水(1 g食鹽，用適量水溶解，濾過，即得)拌勻，悶透，置炒制器內(nèi)，以文火加熱，炒至規(guī)定的程度時取出，放涼，即得鹽制品。3份平行樣。

2.1.5醋制吳茱萸 按照 2015年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》中醋吳茱萸制法和按照2015年版《中國藥典》四部醋灸法(炮制通則0213)：取50 g生藥 (3份平行樣)，用10 g米醋拌勻，悶透，用文火炒至規(guī)定的程度時取出，放涼，即得醋制品。3份平行樣。

2.2 對照品溶液的制備

取吳茱萸堿對照品約 2.0 mg、吳茱萸次堿對照品約1.2 mg和檸檬苦素對照品2.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到含吳茱萸堿0.081 2 mg·mL-1、吳茱萸次堿0.050 4 mg·mL-1、檸檬苦素0.101 8 mg·mL-1的混合溶液，即為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取2.1項下的5種吳茱萸樣品適量，打粉，過三號篩。取粉末約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[1]。

2.4 色譜條件

色譜柱：島津C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長為215 nm；流動相：[乙腈-四氫呋喃(25∶15)]-0.02%磷酸溶液(35∶65)；進樣量：10 μL。對照品及供試品色譜圖見圖1。

注：A.對照品；B.吳茱萸藥材；C.甘草制吳茱萸；D.姜制吳茱萸；E.鹽制吳茱萸；F.醋制吳茱萸；1.檸檬苦素；2.吳茱萸堿；3.吳茱萸次堿。圖1 吳茱萸藥材及炮制品HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

取2.2項下對照品溶液，分別進樣2.0、4.0、6.0、8.0、10 μL，按2.4項下色譜條件測定峰面積值。以進樣量為橫坐標(X)，峰面積值為縱坐標(Y)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明3 種成分在進樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素的 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.6 精密度試驗

精密吸取2.3項下方法制備的湖南岳陽產(chǎn)吳茱萸藥材供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，并記錄色譜峰的峰面積，結(jié)果表明，檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的峰面積的RSD分別為2.1%、2.5%、3.0%。說明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取2.3項下方法制備的湖南岳陽產(chǎn)吳茱萸藥材供試品液10 μL，分別于 0、2、3、8、12、24 h測定檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的峰面積。在24 h內(nèi)其RSD分別為1.8%、2.7%、3.1%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

取同一批湖南岳陽產(chǎn)吳茱萸藥材樣品5份，按2.3項下方法制備供試品液，按2.4項下色譜條件測定其檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量，結(jié)果檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量(n=5)的 RSD分別為1.5%、2.3.%、2.9%。表明該方法重復性較好。

2.9 加樣回收率試驗

稱取已測含量的湖南岳陽產(chǎn)吳茱萸藥材樣品6份(檸檬苦素質(zhì)量分數(shù)為1.583%、吳茱萸堿質(zhì)量分數(shù)為0.452%、吳茱萸次堿質(zhì)量分數(shù)為0.248%)約0.1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入已知含量的對照品混合溶液5 mL，按2.3項下方法進行處理，按2.4項下色譜條件進行分析，計算回收率。結(jié)果見表2。結(jié)果表明樣品回收率符合要求。

2.10 樣品指標成分測定結(jié)果

分別取2.1項下方法制的吳茱萸藥材、甘草制、姜制、鹽制和醋制吳茱萸樣品，按2.3項下方法制備樣品溶液。精密吸取10 μL進樣測定，按外標法計算樣品中檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量。平行測定3次，結(jié)果取平均值，測定結(jié)果見表3。

表2 檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表3 吳茱萸及不同炮制品中3種指標成分含量的測定結(jié)果(n=3) %

以湖南岳陽產(chǎn)吳茱萸炮制前后3種指標成分比較，結(jié)果見圖2。

圖2 湖南岳陽產(chǎn)吳茱萸炮制前后指標成分含量比較

由表3和圖2可知，5個不同產(chǎn)地的吳茱萸藥材，含有的檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量也有差異；同一產(chǎn)地不同炮制品中檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量變化明顯；檸檬苦素含量變化趨勢：藥材>姜制品>醋制品>鹽制品>甘草制品；吳茱萸堿含量變化趨勢：藥材>甘草制品>醋制品>鹽制品>姜制品；吳茱萸次堿含量變化趨勢：藥材>甘草制品>醋制品>鹽制品>姜制品。

3 討論

《中國藥典》(2015年版)收載吳茱萸炮制項目有吳茱萸和制吳茱萸，其中制吳茱萸為甘草汁制，其方法為：取甘草搗碎，加適量水，煎湯，去渣，加入凈吳茱萸，悶潤吸盡后，炒制微干，取出，干燥，每100 kg 吳茱萸用甘草6 kg[1]?，F(xiàn)今對于吳茱萸的炮制研究中均以制吳茱萸飲片品種為主，因為吳茱萸經(jīng)甘草炮制后能降低毒性、緩和燥性[8]，達到增效解毒目的。本實驗按照法定標準中規(guī)定的方法炮制了5個產(chǎn)地共25個吳茱萸樣品，所測吳茱萸藥材和不同炮制品中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的總量為0.420%～0.786%、檸檬苦素的質(zhì)量分數(shù)為0.724%～1.763%，均高于《中國藥典》(2015年版)規(guī)定的炮制品下限(吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量≥0.15%，檸檬苦素≥ 0.2%)。

實驗數(shù)據(jù)顯示，甘草制吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿總量與吳茱萸藥材相比無明顯變化，而醋制中3種指標成分都高于鹽制和姜制，吳茱萸的醋制品有引藥入肝、理氣止血、散癖止痛等[10]的作用，與吳茱萸醋制后3種指標成分的變化是否有關(guān)聯(lián)性還需進一步研究。姜制吳茱萸中3種指標成分的含量最低。炮制品中檸檬苦素與吳茱萸藥材相比含量明顯降低，可能與檸檬苦素中的內(nèi)酯容易水解有關(guān)。該研究為吳茱萸不同炮制品在臨床的應(yīng)用提供了有利依據(jù)，但臨床作用機制還有待進一步研究。

產(chǎn)地不同的吳茱萸藥材，檸檬苦素和吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量也有差異，可能與產(chǎn)地環(huán)境、采收時間、吳茱萸品種、樹齡等有關(guān)系。分析實驗數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)，吳茱萸總堿含量偏高的藥材，檸檬苦素的含量偏低，說明吳茱萸檸檬苦素的量和總生物堿的量有某種相關(guān)關(guān)系，具體原因需要進一步實驗研究。