葉夢娜,陳向東,王忠巧,蘭進,張薇薇,宋明海,王憲楠,馬琳
1.天津中醫(yī)藥大學,天津 301617;2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所,北京 100193;3.彝良縣天麻產(chǎn)業(yè)開發(fā)辦公室,云南 昭通 657600;4.撫松縣參王植保有限責任公司,吉林 撫松 134500
天麻GastrodiaelataBl.是蘭科(Orchidaceae)天麻屬(Gastrodia)多年生草本植物,是一種高度退化的蘭科植物。其種子細小量大、無胚乳,研究發(fā)現(xiàn)天麻種子萌發(fā)是由種子萌發(fā)菌提供營養(yǎng)。萌發(fā)菌侵入天麻種子后,天麻種子消化侵入的菌絲獲得營養(yǎng),進而萌發(fā)形成原球莖。目前,天麻種子萌發(fā)率較低,萌發(fā)菌多代繁殖不斷退化,直接影響天麻產(chǎn)量和質(zhì)量。因此,篩選優(yōu)質(zhì)萌發(fā)菌是亟待解決的問題。胞外酶是萌發(fā)菌在其生長發(fā)育過程中參與培養(yǎng)基中養(yǎng)分的分解和吸收的高效工具,不同胞外酶活性的變化在一定程度上反映培養(yǎng)過程中菌絲體生長及相關(guān)產(chǎn)物代謝的情況[1]。本研究通過對03、06萌發(fā)菌不同時期的胞外酶活性測定及菌株生長量測量,為天麻有性繁殖生產(chǎn)篩選優(yōu)良菌株提供參考。
天麻萌發(fā)菌菌株03、06,由中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所生物技術(shù)中心提供。
2,2-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號:L1803054);苯酚(西隴化工股份有限公司,批號:1703042);所有試劑均為分析純。
TG16G型離心機(天津廣豐科技有限公司);BioSpectrometerfluorescence型分光光度計(德國Eppendorf);PHS-3C型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)。
菌絲培養(yǎng)采用改良固體PDA培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配制后高壓滅菌,定量倒入120 mm無菌培養(yǎng)皿中,定量接種。25 ℃暗培養(yǎng),觀察菌落形態(tài),采樣供內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)分子鑒定用。
試管菌絲培養(yǎng)采用木屑-麥麩培養(yǎng)基,按料水比1∶1.5制作培養(yǎng)基,定量裝入大試管中,高壓滅菌。
接種第5天起測量菌絲生長量,除以生長天數(shù)得到菌株的平均生長速度,每5 d測量1次至長滿試管為止,每菌株測量3個試管,取平均數(shù)。
采用Plant Genomic DNA Kit試劑盒(離心柱型)提取03菌株和06菌株的DNA,采用真菌通用引物ITS-1(5′ TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對ITS序列進行PCR擴增。PCR 反應(yīng)體系50 μL:2×TaqMaster Mix 25 μL,引物ITS-1 2 μL,引物ITS-4 2 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O補齊至50 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃ 55 s,30個循環(huán);72 ℃延伸 2 min,4 ℃保存。將試驗陽性PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序,將測序結(jié)果整理后提交National Center for Biotechnology Information 數(shù)據(jù)庫,利用BLAST進行序列比對,下載相似序列后利用Mega 7.0的鄰接(NJ)法(Bootrap:1000;Gaps/Missing Data Pairwise Deletion;Model:Kmura 2-parameter;Substiutions to Include:Tranations+Transversion)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
將03菌株和06菌株分別與4 ℃貯藏30 d的紅天麻種子進行拌播,以紫萁小菇作為對照,并在MS培養(yǎng)基上進行無菌萌發(fā)實驗,60 d時統(tǒng)計萌發(fā)率。
隨機取菌絲生長線下的培養(yǎng)基1.0 g,加入5 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH=4.0,0.2 mol·L-1),室溫浸提4 h,12 000 r·min-1(離心半徑為8.8 cm)離心15 min,吸出1 mL上清液于10 mL量瓶中定容至刻度,用于胞外酶活性測定。
采用2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)法[2]測定漆酶活性,3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[3]分別測定纖維素酶活性、木聚糖酶活性、果膠酶活性及淀粉酶活性。
ABTS法:將0.5 mL 0.5 mmol·L-1ABTS與1.0 mL Na2HPO4-C6H8O7緩沖液混合均勻,加入0.5 mL稀釋后的酶液。記錄420 nm處3 min內(nèi)的吸光度變化,1個酶活單位定義為反應(yīng)體系中每分鐘催化1 μmol ABTS所需酶量。
DNS法:在刻度試管中分別加入1.5 mL用0.1 mol·L-1的醋酸緩沖液(pH=4.6)配制的1% CMC-Na溶液,0.1 mL稀釋后的酶液,40 ℃水浴保溫30 min,取出后立即加入1.5 mL DNS試劑,沸水浴加熱5 min,待冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL,于500 nm測定吸光度。1%木聚糖溶液、1% 果膠溶液、1% 淀粉溶液,與1% CMC-Na溶液配制方法和測定方法相同。不同的是,測定木聚糖酶活力時,稀釋至20 mL后測定吸光度;測定淀粉酶活力時,于50 ℃水浴保溫30 min。
以上測定過程中空白對照均為加熱滅活后的稀釋酶液,分別按葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸標準曲線,計算底物被酶分解的葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸的含量,1個酶活單位定義為每分鐘生成1 μmol葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸所需要的酶量。
葡萄糖標準曲線:移取0~1.0 mL的0.1 mg·mL-1葡萄糖標準液至10 mL量瓶中,用蒸餾水補充至2.0 mL,空白對照為2.0 mL蒸餾水。采用苯酚-濃硫酸法[3]測定420 nm的吸光度,繪制葡萄糖標準曲線為Y=41.986X+0.002 2(r=0.999 8)。
木糖標準曲線:移取0~1.0 mL的5.0 mg·mL-1木糖標準液至25 mL量瓶中,用醋酸緩沖液補充至1.0 mL,空白對照為1.0 mL醋酸緩沖液。加入2.0 mL DNS試劑,沸水浴5 min后用醋酸緩沖液定容至20 mL。測定500 nm下的吸光度,繪制木糖標準曲線為Y=2.366 9X-0.008 5(r=0.999 1)。
半乳糖醛酸標準曲線:半乳糖醛酸標準液質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1,除定容至10 mL后測定吸光度,其余步驟同木糖標準曲線,測得半乳糖醛酸標準曲線為Y=12.206X-0.017 6(r=0.999 1)。
漆酶活性用公式(1)計算,其他酶活性用公式(2)計算。
(1)
(2)
式中:ε:ABTS吸光系數(shù)36 000 L·mol-1·cm-1;V酶:加入酶液的體積(L);V總:反應(yīng)體系總體積(L);m:根據(jù)標準曲線算得的質(zhì)量(μg);M:摩爾質(zhì)量;t:反應(yīng)時間;n:稀釋倍數(shù);單位:U·L-1。
運用Excel表格統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)結(jié)果,采用SPSS 17.0進行獨立樣本t檢驗以比較數(shù)據(jù)差異性。
2種菌株菌絲呈絨毛狀、邊緣整齊,06菌株菌絲較03菌株菌絲潔白、濃密(見圖1),03菌株生長速度快于06菌株。
注:A.03菌株;B.06菌株。圖1 2株萌發(fā)菌菌株菌落形態(tài)
2株萌發(fā)菌ITS的PCR擴增結(jié)果顯示其序列大小在750 bp 左右。菌株與Mycena中的ITS序列具有99%的高度相似性,結(jié)合菌株菌落形態(tài)認為,03菌株和06菌株均為小菇屬萌發(fā)菌。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。
培養(yǎng)60 d時,03、06菌株與紫萁小菇的萌發(fā)率分別為64.0%、42.4%和52.8%,MS培養(yǎng)基上未觀察到種子萌發(fā)(見圖3)。
圖2 2株萌發(fā)菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
注:A.03菌株拌播種子;B.06菌株拌播種子;C.紫萁小菇;D. MS培養(yǎng)基播種天麻種子。圖3 3株萌發(fā)菌及MS培養(yǎng)基上種子萌發(fā)情況
接種第5天開始,每5 d測量生長量,并換算成生長速度(見表1),2株萌發(fā)菌均在第25天達到生長的高峰,03、06菌株的生長速度分別為0.303、0.295 cm·d-1。第25天以后生長放緩,在生長過程中03菌株的生長速度均大于06菌株,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),結(jié)果表明03菌株在生長速度上優(yōu)于06菌株。
表1 03、06菌株不同時期生長速度 cm·d-1
3.4.1漆酶活性 03、06菌株漆酶活性均表現(xiàn)為先增長的趨勢(見圖4),并在第15天時達到最高值,分別為19.50、19.44 U·g-1;在第20天均降至最低值。培養(yǎng)第21天后06菌株漆酶活性又開始上升,第30天出現(xiàn)第2次高峰,此時06菌株漆酶活性為13.42 U·g-1,是03菌株漆酶活性的1.5倍。第25天以后,06菌株漆酶活性均高于03菌株,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
3.4.2纖維素酶活性 從圖4可見,06菌株纖維素酶活性第10天達到最高值(見圖5),而03菌株纖維素酶活性則在第15天達到最高值;纖維素酶活性分別為0.54、0.63 U·g-1。達到最高值后纖維素酶活性均開始降低,到第40天時06、03菌株的纖維素酶活性分別降至0.27、0.19 U·g-1,此時06菌株纖維素酶活性比03菌株高42.1%。
注:*P<0.05;**P<0.01;下同。圖4 03、06菌株不同時期胞外漆酶活力變化
圖5 03、06不同時期胞外纖維素酶活力變化
3.4.3木聚糖酶活性 03、06菌株萌發(fā)菌木聚糖酶活性變化趨勢與纖維素酶活性相近,也是隨著培養(yǎng)時間的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(見圖6)。不同于纖維素酶活性變化趨勢的是03菌株木聚糖酶活性在第10天達到最高值,而06菌株在第15天達到最高值;在第15天,06菌株的木聚糖酶活性約為03菌株的1.6倍。在培養(yǎng)過程中06菌株的木聚糖酶活性均高于03菌株,統(tǒng)計分析顯示03、06菌株萌發(fā)菌木聚糖酶活性差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
圖6 03、06不同時期胞外木聚糖酶活力變化
3.4.4果膠酶活性 03、06菌株果膠酶活性變化趨勢與其他酶活力變化趨勢相似(見圖7),但是達到最高酶活性時間均推遲到培養(yǎng)第25天,03菌株果膠酶活性為2.73 U·g-1,比06菌株高12.3%。在培養(yǎng)不同階段03菌株果膠酶活性均高于06菌株,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
圖7 03、06不同時期胞外果膠酶活力變化
圖8 03、06不同時期胞外淀粉酶活力變化
3.4.5淀粉酶活性 03、06菌株淀粉酶活性均在培養(yǎng)第15天時達到最高值(見圖8),06菌株的淀粉酶活性是0.560 U·g-1,比03菌株高41.1%;淀粉酶活性培養(yǎng)第40天時為最低,03、06菌株的淀粉酶活性分別是0.193、0.264 U·g-1;從曲線圖可見在03、06菌株生長過程中,06菌株的淀粉酶活性均高于03菌株,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
ITS序列分析技術(shù)是常用的分子生物學鑒定方法,可以檢測和對比傳統(tǒng)形態(tài)學無法區(qū)分鑒別的相似菌株種間或種內(nèi)的差別,具有快速、靈敏、準確的優(yōu)點。本研究將03、06菌株的ITS序列測序后,提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中,建立系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合菌株菌落形態(tài)認為03、06菌株為2種不同的小菇屬萌發(fā)菌。萌發(fā)實驗表明03、06菌株均有促進天麻種子萌發(fā)的作用。
在培養(yǎng)前期,2株萌發(fā)菌生長速度逐漸增加,均在第25天達到生長的高峰,后期2種菌株生長速度有所減緩。03菌株先于06菌株長滿試管,兩者生長速度存在差異。
萌發(fā)菌為木腐菌,其生長與胞外酶活性密切相關(guān)。目前對萌發(fā)菌胞外酶活性變化規(guī)律的研究報道較少,并且只是在液體發(fā)酵培養(yǎng)方面,木屑培養(yǎng)基菌株胞外酶活性研究未見報道。一般木材中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量分別為40%~ 50%、10%~ 30%、20%~ 30%,萌發(fā)菌生長過程中向胞外分泌的漆酶能加速木質(zhì)素芳香族高分子化合物的分解;胞外纖維素酶將纖維素分解為纖維二糖和寡糖,最終水解為葡萄糖被萌發(fā)菌吸收利用;木聚糖是植物半纖維素的主要組成部分,胞外木聚糖酶可以使其分解[4-8]。在生長階段,兩株萌發(fā)菌均分泌了漆酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和淀粉酶,這5種胞外酶活性變化規(guī)律基本一致,但表現(xiàn)出明顯的階段性。不同菌株的同種胞外酶酶活性大小有所差異,03菌株各個時期的木聚糖酶和淀粉酶活性低于06菌株,說明06菌株分解培養(yǎng)基半纖維素類成分的能力強于03菌株。在培養(yǎng)后期06菌株的漆酶活性不降反升,可能是因為前期貯存的營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)不能滿足菌絲迅速生長的需要,從而誘導分泌木質(zhì)素分解酶以分解利用培養(yǎng)基中的木質(zhì)素物質(zhì)獲得營養(yǎng)。在實際生產(chǎn)過程中,萌發(fā)菌生長速度緩慢,針對不同的萌發(fā)菌菌株,可以采用不同的培養(yǎng)基,以加快菌絲生長和縮短菌種培養(yǎng)周期。
本研究根據(jù)2種菌株的生長量、不同時期的胞外酶活性及萌發(fā)實驗的研究結(jié)果,初步篩選出03為優(yōu)勢菌株,可為實際生產(chǎn)中對萌發(fā)菌培養(yǎng)基進行改進及優(yōu)質(zhì)萌發(fā)菌的選擇提供科學依據(jù)。對于不同萌發(fā)菌分解吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的調(diào)控機制還需進一步深入研究。