薦紅舉 霍 強 高玉敏 李陽陽 謝 玲 魏麗娟 劉列釗 盧 坤 李加納,*

用全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選甘藍型油菜葉片葉綠素含量候選基因

薦紅舉1,2,**霍 強1,2,**高玉敏1,2李陽陽1,2謝 玲1,2魏麗娟1,2劉列釗1,2盧 坤1,2李加納1,2,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715;2西南大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715

提高油菜產(chǎn)量是保障國家糧油安全的重要舉措。作物“源”“流”“庫”理論表明, 充足的光合產(chǎn)物(源)是高產(chǎn)的前提, 而葉綠素是直接參與光合作用的物質(zhì), 因此, 選育高葉綠素含量的甘藍型油菜是提高產(chǎn)量的重要途徑。本課題組前期對全球收集的588份優(yōu)異油菜種質(zhì)資源進行5X重測序, 獲得385,692個高質(zhì)量SNP標(biāo)記。利用SPAD-502葉綠素儀于2018—2019連續(xù)2年測定苗期完全伸展的葉片葉綠素總量, 結(jié)合獲得的SNP標(biāo)記進行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS), 篩選與葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點。結(jié)果表明, 2018年鑒定到5個顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點, 貢獻率為5.51%~7.89%, 其中S6_3493805位點貢獻率最大; 2019年檢測到46個SNP位點, 貢獻率為7.29%~10.34%, 其中S13_11413088位點貢獻率最大。將顯著關(guān)聯(lián)SNP位點上下游各500 kb區(qū)間內(nèi)的基因與參考基因組比對, 初步篩選出2022個油菜基因。將其基因序列在擬南芥基因組內(nèi)進行BLAST比對, 結(jié)合前人已報道的擬南芥同源基因功能, 篩選到23個候選基因, 其中5個屬于葉綠素合成途徑同源基因。本研究結(jié)果為后續(xù)油菜葉片葉綠素含量的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

甘藍型油菜; 葉綠素含量; 全基因組關(guān)聯(lián)分析; 候選基因

油菜是中國四大油料作物之一, 也是產(chǎn)油效率最高的油料作物, 而菜籽作為我國食用植物油的最大來源, 自給率嚴(yán)重不足, 因此, 提高油菜產(chǎn)量和含油量是油菜育種的迫切目標(biāo)。葉綠素是光合作用的重要色素, 篩選并研究控制油菜葉綠素含量的基因?qū)μ岣哂筒水a(chǎn)量具有重要意義。

葉綠素在光合作用中能夠吸收光能并參與能量傳遞[1]。在生物學(xué)和遺傳學(xué)上已經(jīng)對葉綠素代謝進行了廣泛的研究[2-4]。葉綠素的生物合成首先是葉綠素前體L-谷氨酰tRNA (ALA)到原卟啉IX的合成[4-5], 然后通過ALA脫水酶(ALAD)將ALA的2個分子縮合成吡咯分子, 即膽色素原。再通過酶的連續(xù)轉(zhuǎn)化和原卟啉IX的金屬螯合反應(yīng)來劃分通路, 從而指導(dǎo)最終產(chǎn)物葉綠素和血紅素的形成[4]。在黑暗中, 葉綠素的生物合成分支在中間原葉綠素酸酯(Pchlide)被阻斷, 因為原葉綠素酸酯向葉綠素的轉(zhuǎn)化是由依賴光的NADPH催化的[6]。然而, 過量的原葉綠素酸酯游離和其他吡啶中間體在黑暗中積累可能在光照射下產(chǎn)生活性氧(ROS), 從而導(dǎo)致子葉光漂白甚至細胞死亡[7]。因此, 葉綠素的生物合成在植物生長發(fā)育過程中扮演著重要的角色。葉綠素生物合成相關(guān)基因的表達差異造成了葉綠素含量的不同。

葉片是植物光合作用的主要場所, 也是植物源到庫的重要源場所。而植物葉色突變體的葉色主要表現(xiàn)在苗期。甘藍型油菜中的葉色黃化突變體BnaC.ygl是由于血紅素加氧酶(HO1)的活性降低導(dǎo)致血紅素的積累, 從而抑制了葉綠素合成前體ALA的合成, 造成葉綠素生物合成受到抑制導(dǎo)致葉色變黃[8]; 玉米中5個黃化突變體是由于、、、和缺失所引起, 這5個基因與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成相關(guān), 相關(guān)基因的缺失導(dǎo)致細胞中含有較少的質(zhì)體核糖體和光合復(fù)合物, 表明PEP在葉綠素生物合成中起到關(guān)鍵作用[9]。植物光合作用可以通過葉綠素將CO2和H2O轉(zhuǎn)化為可儲存的有機物, 因此葉綠素是植物有機物積累的重要物質(zhì)。通過降低葉綠素降解的時間可以增加產(chǎn)量[10]。另外, 葉片中葉綠素的含量也與作物粒飽滿程度、有機物積累及單株產(chǎn)量顯著相關(guān)[11]。

近年來在高粱[12]、玉米[13]、小麥[14]、水稻[15]、大豆[16]等植物中進行了葉綠素相關(guān)研究, 但關(guān)于甘藍型油菜葉片葉綠素含量相關(guān)基因鑒定的報道較少[17-18]。Ge等[19]利用白菜一個F2:3群體2年的葉綠素a和葉綠素b含量數(shù)據(jù)進行QTL定位, 一共檢測到10個QTL, 單個QTL解釋表型率為7%~17%。Wang等[17]利用一個甘藍型油菜葉綠素缺失突變體和中雙11構(gòu)建的F2群體及620個F2:3群體將基因定位在一個長度為311 kb區(qū)間內(nèi), 該定位區(qū)間包括22個候選基因; Qian等[18]探究了甘藍型油菜中的缺失對光系統(tǒng)(LHC)相關(guān)基因表達及光合反應(yīng)中心蛋白PSI和PSII表達的影響以及對籽粒油脂積累的影響, 同時也發(fā)現(xiàn)攜帶基因也會影響株高。

隨著高通量測序技術(shù)的成熟以及基因型分型成本的降低, 全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association)已經(jīng)成為植物基因探究以及復(fù)雜性狀解析的重要方法[20]。全基因組關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)在棉花[21-22]、楊樹[23]、大豆[24]等植物中廣泛應(yīng)用。本研究對588份甘藍型油菜自然群體的葉片進行2年葉綠素含量測定并進行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 篩選出控制甘藍型油菜葉片葉綠素含量相關(guān)的候選基因, 為油菜葉綠素含量的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗材料

用于關(guān)聯(lián)分析的588份甘藍型油菜是由全球各地征集的油菜品種組成, 其中大部分來自中國重慶、湖北、湖南、江蘇、陜西等地, 部分來自加拿大、德國、瑞典、丹麥、澳大利亞等國家。所有材料由重慶市西南大學(xué)油菜工程中心提供。

1.2 田間試驗與葉綠素測定

該群體于2017—2018年, 2018—2019年連續(xù)種植于重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)油菜基地。采用隨機區(qū)組設(shè)計, 2個重復(fù), 以育苗移栽方式每小區(qū)種植3行, 每行15株, 行距40 cm, 株距20 cm。按照常規(guī)生產(chǎn)方式進行田間管理。在植株苗期用SPAD-502Plus葉綠素儀測定完全伸展的葉片中間部位葉綠素含量, 對每個品種測定5株。利用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計分析軟件進行描述性統(tǒng)計分析并制作正態(tài)分布圖。

1.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法

參考文獻進行基因型數(shù)據(jù)測定與分析、群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系分析與連鎖不平衡分析[25]。全基因組關(guān)聯(lián)分析采用naive、Q、PCA、K、Q+K和PCA+K六種統(tǒng)計模型來評估群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的影響(Q: 群體結(jié)構(gòu); PCA: 主成分; K: 親緣關(guān)系), 進行表型和SNP關(guān)聯(lián)分析。運用TASSEL 5.0軟件進行這6種模型的關(guān)聯(lián)分析, 其中使用一般線性模型(GLM)分析naive、Q和PCA模型, 使用混合線性模型(MLM)分析K、Q+K和PCA+K模型。利用SAS軟件檢測這6種模型的運算結(jié)果, 對其lg()的觀測值和lg()期望值繪制Quantile-quantile散點圖, 通過QQ圖比較后確定最佳模型, 在最佳模型下進行葉片葉綠素含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析, 利用R軟件作Manhattan圖。本試驗使用的SNP數(shù)據(jù)為385,692個,值小于閾值(1/385,692 = 2.593E-06)的位點為顯著關(guān)聯(lián)位點。

1.4 候選基因的挖掘

根據(jù)甘藍型油菜“Darmor-bzh”參考基因組[26], 提取分析得到的葉片葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記各位點500 kb內(nèi)的基因[27]; 將需要功能分析的基因序列與擬南芥所有基因序列進行BLASTn比對, e-value閾值為1e-10, 并以同源性最高的擬南芥基因作為待分析基因進行功能注釋來篩選與葉綠素含量相關(guān)的候選基因。

1.5 候選基因驗證

對葉綠素含量極端材料在苗期取3個生物學(xué)重復(fù)的葉片并提取RNA。根據(jù)前期所取材料的葉片提取的RNA, 使用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 用于qRT-PCR驗證。以油菜作為內(nèi)參基因, 使用TaKaRa公司的SYBR Premix ExII試劑盒進行qRT-PCR驗證候選基因的相對表達量。設(shè)置每個樣品3次技術(shù)重復(fù)。在BIO-RAD定量PCR儀上進行qRT-PCR擴增。在網(wǎng)站http://biodb.swu.edu.cn/ qprimerdb上查找設(shè)計候選基因的qRT-PCR引物(表1), 由上海生工生物工程有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量表型分析

自然群體中, 葉綠素含量在2018年和2019年的變異系數(shù)分別為11.27%和12.73%, 2年間的變異系數(shù)較為穩(wěn)定(表2)。自然群體2年葉綠素含量表現(xiàn)出連續(xù)正態(tài)分布(圖1), 說明該性狀符合由多基因控制的數(shù)量性狀特點, 適合全基因組關(guān)聯(lián)分析。

表1 候選基因引物

表2 甘藍型油菜葉綠素含量的表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

SD: standard deviation; CV: coefficient of variation.

圖1 甘藍型油菜葉片葉綠素含量的頻次分布

2.2 甘藍型油菜葉片葉綠素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

對葉綠素含量關(guān)聯(lián)分析6種模型下的結(jié)果繪制Quantile-quantile散點圖(圖2), 由圖2可知, 最佳模型為P+K模型。在最佳模型下, 利用385,692個SNPs, 以值小于閾值(1/385,692 = 2.593E-06)確定顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(表3), 并繪制Manhattan圖(圖3)。

2018年檢測到5個SNP位點, 分別位于A01 (1個)、A06 (2個)、A10 (1個)和C04 (1個)染色體, 它們的貢獻率為5.51%~7.89%, 其中S6_3493805位點貢獻率最大; 2019年檢測到46個SNP位點, 分別位于A01 (8個)、A02 (1個)、A03 (1個)、A04 (1個)、A08 (5個)、A09 (1個)、A10 (1個)、C02 (2個)、C03 (8個)、C04 (4個)、C05 (1個)、C06 (10個)、C08 (2個)和C09 (1個)染色體, 貢獻率為7.29%~10.34%, 其中S13_11413088位點貢獻率最大。

表3 最佳模型下葉綠素含量顯著位點表

(續(xù)表3)

圖2 甘藍型油菜葉綠素含量在各模型中的QQ圖

圖3 甘藍型油菜葉綠素含量在最佳模型中的曼哈頓圖

2.3 甘藍型油菜葉片葉綠素含量候選基因篩選

初步篩選出23個與油菜葉片葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的候選基因, 與擬南芥基因序列進行Blastn比對, 結(jié)合前人已報道的擬南芥同源基因功能, 篩選可能在本研究中發(fā)揮作用的候選基因(表4)。

表4 葉綠素含量候選基因

(續(xù)表4)

2.4 候選基因的驗證

挑選20個候選基因進行熒光定量驗證, 檢測其在2類材料中的表達情況表明, 相比葉綠素含量高的材料, 在葉綠素含量低的材料中, 11個基因上調(diào)表達, 9個基因下調(diào)表達(圖4)。上調(diào)基因包括, 其編碼HEME1蛋白, 下調(diào)基因包括, 其編碼HEMG2, 這些基因均參與葉綠素合成途徑。

圖4 甘藍型油菜葉片葉綠素含量候選基因定量驗證

3 討論

利用數(shù)量性狀座位(quantitative trait loci, QTL)或者全基因組關(guān)聯(lián)分析可以快速鑒定與性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記和基因, 是非常有效的定位候選基因的方法。定位甘藍型油菜重要農(nóng)藝性狀QTL已經(jīng)在產(chǎn)量性狀如千粒重[27]、角果長度[28]和農(nóng)藝性狀如開花期[29]、株高[30]等方面取得重要進展。利用GWAS定位甘藍型油菜復(fù)雜的數(shù)量性狀同樣取得重要進展[31-33]。但是, 影響甘藍型油菜葉片葉綠素含量相關(guān)QTL或者候選基因的研究相對較少, 僅有1篇通過突變體鑒定到的一個候選基因BnaC.YGL[8]。

本研究中, 利用588份全球搜集的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源, 具有較為豐富的表型變異, 葉綠素含量變異范圍廣(表2); 課題組前期已經(jīng)對該資源材料進行重測序, 挖掘出385,692個高質(zhì)量的SNP位點[25], 這些為通過GWAS分析篩選葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)位點奠定基礎(chǔ)。植物合成的葉綠素含量不僅受到遺傳因素的調(diào)控, 也會受到外界環(huán)境的影響, 如外界光照、溫度和營養(yǎng)[34]。而當(dāng)植物葉綠素含量發(fā)生變化, 細胞內(nèi)葉綠素的超微結(jié)構(gòu)、葉片生理生化特征以及葉色調(diào)控機制也都會發(fā)生改變[17]。油菜葉片葉綠素含量受年度間水肥條件和光溫條件差異影響, 基因型與環(huán)境互作較大, 不同環(huán)境下有不同的基因群發(fā)揮作用, 進而造成關(guān)聯(lián)位點的差異。通過測定甘藍型油菜苗期葉片葉綠素含量, 2018和2019年分別篩選出與葉綠素顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點5個和46個。通過對SNP位點上下游各500 kb范圍內(nèi)候選基因的篩選,共得到2022個候選基因, 其中,()、()、()和() 4個基因的同源基因在擬南芥中參與葉綠素合成途徑(表4)。這些將作為重要候選基因進一步分析。

另外, 4個基因參與葉綠體發(fā)育和光合作用過程,如, 編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LIGHT-HARVESTING CHLOROPHYLL-PROTEIN COMPLEX II SUBUNIT B1, LHB1B1), 該蛋白定位在葉綠體膜、類囊體膜上參與光捕獲, 響應(yīng)光刺激[35]。和分別編碼光合系統(tǒng)I的光捕獲復(fù)合體基因2 (PHOTOSYSTEM I LIGHT HARVESTING COMP LEX GENE 2, LHCA2)和LHCA6, 都定位在葉綠體類囊體膜, 參與光捕獲過程[36-37]。編碼光調(diào)控的鋅指蛋白1 (light-regulated zinc finger protein 1, LZF1), 又名B-box domain protein 22 (BBX22和DBB3), 其定位在細胞核, 參與含花青素的復(fù)合生物合成過程、葉綠素生物合成過程、葉綠體組織等調(diào)控過程[38-39]。

4 結(jié)論

2年分別鑒定到5個和46個顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記, SNP位點上下游500 kb區(qū)間內(nèi)共篩選出23個與葉綠素合成途徑相關(guān)的候選基因, 并進行了定量驗證, 本研究為油菜后續(xù)葉片葉綠素含量的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

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[38] Chang C S J, Li Y H, Chen L T, Chen W C, Hsieh W P, Shin J, Jane W N, Chou S J, Choi G, Hu J M, Somerville S, Wu S H. LZF1, a HY5-regulated transcriptional factor, functions inde-etiolation., 2008, 54: 205–219.

[39] Chang C S J, Maloof J N, Wu S H. COP1-mediated degradation of BBX22/LZF1 optimizes seedling development in., 2011, 156: 228–239.

Selection of candidate genes for chlorophyll content in leaves ofusing genome-wide association analysis

JIAN Hong-Ju1,2,**, HUO Qiang1,2,**, GAO Yu-Min1,2, LI Yang-Yang1,2, XIE Ling1,2, WEI Li-Juan1,2, LIULie-Zhao1,2, LU Kun1,2, and LI Jia-Na1,2,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

Increasing rapeseed production is important to ensure the national food and oil security. According to the theory of crop source and sink, sufficient photosynthate (sources) is the premise of high yield, and chlorophyll is the important substance for photosynthesis. Therefore, breeding high chlorophyll contentis an important way to ensure high yield. In our previous study, 588 excellent germplasm resources collected worldwide were re-sequenced with 5and 385,692 high-quality SNP markers were obtained. SPAD-502 chlorophyll meter was used to measure the total chlorophyll content of mature leaves in 2018–2019. Genome wide association study (GWAS) was conducted to screen SNP sites significantly related to chlorophyll content. Five SNP loci were identified in 2018, with a contribution rate of 5.51%–7.89%, of which S6_3493805 had the largest contribution. 46 SNP loci were detected in 2019, with a contribution rate of 7.29%–10.34%, of which S13_11413088 had the largest contribution. In total, 2022 rapeseed genes were screened out by comparing the reference genome with genes in the regions of the 500 kb before and after the SNP. Based on the function ofhomologous genes previously reported, screened 23 candidate genes, among which five were homologous genes in chlorophyll synthesis pathway. These results lay a foundation for the genetic improvement of chlorophyll content in leaves ofin future.

; chlorophyll content; GWAS; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2020.04007

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0100504-05)和重慶市民生工程主題專項(cstc2016shms-ztzx80020)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0100504-05) and the Special Project of Chongqing People’s Livelihood (cstc2016shms-ztzx80020).

李加納, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 023-68250701

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

薦紅舉, E-mail: hjjian518@swu.edu.cn; 霍強, E-mail: 354011524@qq.com

2020-01-12;

2020-04-15;

2020-04-27.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200427.0825.004.html