劉 榮 王 芳 方 俐 楊 濤 張紅巖 黃宇寧 王 棟,3 季一山 徐東旭 李 冠 郭瑞軍 宗緒曉,*

利用2個F2群體整合中國豌豆高密度SSR遺傳連鎖圖譜

劉 榮1,**王 芳1,**方 俐1,**楊 濤1張紅巖1黃宇寧1王 棟1,3季一山1徐東旭2李 冠1郭瑞軍1宗緒曉1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所作物種質資源中心, 北京 100081;2張家口市農(nóng)業(yè)科學院食用豆類研究所, 河北張家口 075000;3山東省作物種質資源中心, 山東濟南 250100

豌豆(L.)是一種重要的食用豆類作物, 在全世界范圍內(nèi)廣泛種植, 既可作為人類食物, 也可作為牲畜飼料。用SSR標記構建的遺傳連鎖圖譜在豌豆和其他作物的標記輔助育種中發(fā)揮著重要的作用。盡管對豌豆遺傳連鎖作圖的研究已有悠久歷史, 但公眾可獲得且可轉移的SSR標記以及基于遺傳獨特的中國豌豆種質的高密度遺傳連鎖圖譜仍然有限。為了獲得更多可轉移的SSR標記和中國豌豆的高密度遺傳連鎖圖譜, 本研究首先從自主開發(fā)和文獻獲取的12,491個全基因組SSR標記中篩選了617個多態(tài)性SSR標記, 并用于G0003973×G0005527 F2群體遺傳連鎖圖譜的加密。加密后的圖譜全長擴展到5330.6 cM, 包含603個SSR標記, 標記平均間距離8.8 cM, 相比之前的圖譜有明顯改善?；谏鲜鼋Y果, 我們又篩選了119個具有多態(tài)性的SSR標記, 用于構建大樣本W(wǎng)6-22600×W6-15174 F2群體的遺傳連鎖圖譜, 新圖譜累積長度為1127.1 cM, 包含118個SSR標記, 裝配在7條連鎖群上。最后, 將來自以上2個遺傳圖譜的數(shù)據(jù)進行整合, 得到了一張覆蓋范圍6592.6 cM的整合圖譜, 包含668個SSR標記, 由509個基因組SSR、134個EST-SSR和25個錨定標記組成, 分布在7條連鎖群上。這些SSR標記和遺傳連鎖圖譜將為豌豆的遺傳研究和標記輔助育種提供有力工具。

豌豆; SSR; 遺傳連鎖圖譜; 整合圖譜; 標記輔助育種

豌豆(L.)屬于豆科(Leguminosae/ Fabaceae), 野豌豆族(Vicieae), 豌豆屬(), 染色體數(shù)為2= 2= 14, 基因組大小約為4.45 Gb[1-2]。豌豆富含蛋白質和多種營養(yǎng)元素, 是經(jīng)濟上最重要的食用豆類作物之一, 在世界范圍內(nèi)廣泛種植, 既可以作為谷物和蔬菜供人類食用, 又可作為牲畜的飼料[3-4]。根據(jù)FAO的統(tǒng)計, 2018年, 豌豆(包括青豌豆和干豌豆)在全球食用豆類作物中的總產(chǎn)量僅次于普通菜豆; 同時, 中國青豌豆的總產(chǎn)量居世界首位, 而干豌豆的總產(chǎn)量僅次于加拿大和俄羅斯[5]。此外, 豌豆因其固氮能力而被認為是一種環(huán)境友好型作物, 在可持續(xù)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中起著至關重要的作用[6]。

高密度遺傳連鎖圖譜是功能基因定位、比較基因組學以及分子輔助育種等研究的重要工具[7]。以前, 人們一直致力于利用包括RFLP、RAPD、SSR和SNP在內(nèi)的多種分子標記基于不同類型的群體來構建豌豆的遺傳連鎖圖譜[8-15]。最近, 有學者針對豌豆開發(fā)了基于高密度SNP的遺傳連鎖圖譜, 并為鑒定重要農(nóng)藝性狀的遺傳基礎提供了強大的工具[16-19]。此外, 新近公布的豌豆參考基因組也為理解豌豆關鍵農(nóng)藝性狀的分子基礎并促進其育種改良奠定了重要基礎[20]。

SSR標記因其具有信息量豐富、共顯性遺傳、多等位基因、基因組覆蓋廣等特性, 同時在相近物種之間具有可重復性和可移植性[21-22], 在遺傳多樣性評估和物種親緣關系鑒定[23-24]、遺傳連鎖圖譜構建[25-26]、標記輔助選擇[27-28]、DNA指紋圖譜鑒定[29-30]等方面具有顯著優(yōu)勢。相比基因組SSR, 位于基因區(qū)的EST-SSR因其具有更高的可轉移性、較低的開發(fā)成本以及與基因的密切關系, 而越來越受到人們的重視[11,21]。然而, 盡管針對豌豆的遺傳連鎖作圖研究已有很長的歷史, 并且在豌豆中已經(jīng)構建了幾十種具有不同標記的遺傳連鎖圖譜[31], 但公眾可獲得的可用于豌豆遺傳研究的SSR上圖標記較少, 同時基于遺傳獨特的中國豌豆種質[1,32-33]的遺傳連鎖圖譜仍然有限。值得注意的是, 過去基于中國豌豆種質構建的遺傳連鎖圖譜包括157個SSR標記, 分布在11個連鎖群中, 全長1518 cM, 標記數(shù)量較少, 需要進一步加密并完善至7個連鎖群[15]。

與單個遺傳連鎖圖譜相比, 整合遺傳連鎖圖譜由于整合了多個群體的信息而具有多種優(yōu)勢[34-35], 例如具有更高的標記密度, 更完整的基因組覆蓋范圍, 可對不同群體進行標記共線性比較等, 在許多作物包括豌豆中均有應用[16,20,36-37]。因此, 本研究的目的如下: 1)篩選豌豆中可移植轉換的SSR標記, 用于豌豆的遺傳研究和分子作圖。2)對我們以往基于G0003973×G0005527 F2群體, 構建的遺傳連鎖圖譜進行加密。3)基于W6-22600×W6-15174 F2群體, 構建新的遺傳連鎖圖譜。4)結合上述2個基于中國種質的遺傳連鎖圖譜信息, 構建一張豌豆整合SSR遺傳連鎖圖譜。

1 材料與方法

1.1 作圖群體

本研究利用基于中國豌豆種質為親本的2個F2群體進行遺傳連鎖作圖。群體1 (PSP1)與本實驗室之前的研究相同[15], 來自母本G0003973 (耐寒)和父本G0005527 (不耐寒)之間的雜交, 由190個F2個體組成。群體2 (PSP2)則是以母本W(wǎng)6-22600 (多小葉)與父本W(wǎng)6-15174 (無小葉)進行雜交, 由480個F2個體組成。

1.2 SSR標記篩選

利用本實驗室自主開發(fā)[38]和文獻獲取[39-41]的12,491個SSR標記(包括11,145個基因組SSR和1346個EST-SSR), 對PSP1的親本及隨機選擇的4個F2個體進行全基因組掃描, 篩選出多態(tài)性SSR標記用于遺傳連鎖作圖。此外, 從以往研究中已發(fā)表的豌豆遺傳連鎖圖譜中, 選擇具有已知連鎖群位置的125個SSR標記[10,42-44], 利用PSP1和PSP2的親本和4個隨機選擇的F2個體來篩選錨定標記。

1.3 DNA提取和PCR擴增

在2個F2群體種植當年, 收集每個F2個體植株的嫩葉, 經(jīng)液氮速凍后, 使用改良的CTAB方法[45]提取基因組DNA。用NanoDrop 2000檢測DNA濃度并稀釋到工作液濃度50 ng μL-1后, 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增反應體系為10 μL, 包含1.5 μL基因組DNA (50 ng μL-1)、5 μL 2×PCR Master Mix (Genstar, 中國北京)、0.5 μL正向引物 (2 μmol L-1)、0.5 μL反向引物 (2 μmol L-1)和2.5 μL ddH2O。PCR產(chǎn)物通過8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離, 并通過0.1%硝酸銀染色。根據(jù)片段大小記錄等位基因狀態(tài), SSR標記狀態(tài)編碼如下: 與父本相同的帶型記為“AA”, 與母本相同的帶型記為“BB”; 具有雙親帶型的記為“AB”; 缺失或無效的帶型記為“-”。只有那些能夠擴增出清晰條帶并可以顯示親本多態(tài)性的SSR標記才被選擇用于后續(xù)的基因分型。

1.4 遺傳連鎖圖譜構建

分別對PSP1和PSP2的所有F2個體進行基因分型, 并去除缺失數(shù)據(jù)超過20%的標記或個體。使用χ2分析來檢測標記偏分離狀況, 并使用Bonferroni校正對= 0.05的顯著性水平進行校正, 在進一步的遺傳作圖中排除顯著偏分離的標記。利用Kosambi作圖函數(shù)對2個群體構建遺傳連鎖圖譜, LOD>2。在以往公布的豌豆遺傳連鎖圖譜的基礎上, 通過篩選得到的錨定標記對每個連鎖群進行分組[10,42-44]。然后, 利用共有標記將這2個群體的信息整合到一張遺傳連鎖圖譜上。以上所有分析均利用QTL IciMapping V4.0軟件完成[46]。遺傳連鎖圖譜和物理圖譜利用MapChart V2.3軟件進行可視化展示[47]。然后, 本研究以新近發(fā)表的豌豆基因組為參考(Caméor genome build 1a)[20], 利用KnowPulse網(wǎng)站(https:// knowpulse.usask.ca/blast/nucleotide/nucleotide)的BL ASTn工具對50個共有標記的擴增片段序列進行比對, 參數(shù)選取默認參數(shù), E-value設為1e?3。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)性標記篩選

利用本實驗室自主開發(fā)[38]和文獻獲取[39-41]的12,491個SSR標記(包括11,145個基因組SSR和1346個EST-SSR), 對PSP1的親本及隨機選擇的4個F2個體進行全基因組掃描, 初步篩選出擴增條帶清晰且在父母本間呈多態(tài)性差異的954個多態(tài)性SSR標記, 用于PSP1群體190個F2個體的基因分型, 最終得到729個在190份F2群體單株中有清晰條帶的多態(tài)性標記, 用于后續(xù)遺傳連鎖圖譜的構建。然后利用這729個多態(tài)性標記對PSP2的親本及隨機選擇的4個F2個體進行多態(tài)性檢測, 最終在480個F2個體中成功篩選了103個多態(tài)性標記用于PSP2的遺傳連鎖圖譜構建。

此外, 本研究還利用125個已知遺傳連鎖群位置信息的可公開獲得的SSR標記[10,39-41]在2個群體中篩選錨定標記, 分別在PSP1和PSP2中鑒定出11個和17個錨定標記, 其中有3個標記為2個群體共有的錨定標記, 共計25個錨定標記, 這些標記可在后續(xù)遺傳連鎖圖譜構建中用于分配連鎖群(表1)。

2.2 遺傳連鎖圖譜構建

獲得所有樣本的基因型數(shù)據(jù)后, 首先對所有標記進行數(shù)據(jù)完整性和偏分離檢測。對于PSP1作圖群體, 740個標記(包含11個錨定標記)中, 有43個標記缺失信息大于20%, 占總標記數(shù)的5.81%, 而有80個標記檢測到偏分離現(xiàn)象, 占總標記數(shù)的10.81%。因此, 排除這123個標記后, 共有617個標記用于后續(xù)的遺傳連鎖圖譜分析。針對PSP1構建的遺傳連鎖圖譜, 將603個標記分配到7條連鎖群上。根據(jù)11個錨定標記, PSP1圖譜的7條連鎖群分別對應于以往發(fā)表的遺傳連鎖圖譜的6條連鎖群[10,39-41], 有2條連鎖群均對應于LGI, 而缺少對應于LGV的連鎖群, 可能是由于缺乏LGV的錨定標記。此外, 該圖譜全長5330.6 cM, 相鄰標記之間的平均距離為8.9 cM。每條連鎖群的長度從494.9 cM (LGII)到904.7 cM (LGIV)不等, 平均為761.5 cM; 每條連鎖群的標記數(shù)目從62 (LGII)到113 (LGI-2)不等, 平均為86個標記(圖1和表2)。

表1 篩選得到的25個錨定標記在以往發(fā)表豌豆遺傳連鎖圖譜的分布

圖1 豌豆PSP1群體遺傳連鎖圖譜

粗體代表錨定標記, 標記名稱以“e”開頭的為EST-SSR標記。

The bold labels on the marker name represent anchor markers, and marker names started with “e” represent EST-SSR markers.

表2 利用豌豆PSP1和PSP2群體構建的2個遺傳連鎖圖譜的標記分布

對于PSP2作圖群體來說, 120個標記(包含17個錨定標記)中, 僅有1個標記由于缺失大于20%而被排除在后續(xù)分析之外。剩余的119個標記被用于進一步的連鎖作圖分析, 結果發(fā)現(xiàn)上圖的118個標記分布在7條連鎖群上。根據(jù)17個錨定標記, 這7條連鎖群剛好完全對應于以往發(fā)表的遺傳連鎖圖譜的7個連鎖群[10,39-41]。此外, 該圖譜的累積長度為1127.1 cM, 相鄰標記之間的平均遺傳距離為9.8 cM (圖2和表2)。每條連鎖群的長度從119.0 cM (LG IV)到203.4 cM (LGVII)不等, 平均為161.0 cM; 每條連鎖群的標記數(shù)目從11 (LGI)到21 (LGVI)不等, 平均為17個標記(圖2和表2)。

圖2 豌豆PSP2群體遺傳連鎖圖譜

粗體代表錨定標記。The bold labels on the marker name represent anchor markers.

2.3 整合遺傳連鎖圖譜構建

基于以上2個遺傳連鎖圖譜, 通過兩兩比較共發(fā)現(xiàn)了53個共有標記, 每個連鎖群上的共有標記數(shù)為3 (LGI)到14 (LGVII)不等(表3)。利用上述2個遺傳連鎖圖上的53個共有標記, 我們構建了一張包含668個SSR標記的整合遺傳連鎖圖譜(標記信息詳見附表1), 分布在7條連鎖群上, 累積長度為6592.6 cM, 相鄰標記之間的平均距離為10.0 cM。每條連鎖群的長度從682.7 cM (LGII)到1077.2 cM (LGIII)不等, 平均為941.8 cM。在這7條連鎖群中, 分布在LGV的標記數(shù)量最多, 有125個標記, 同時標記密度也最低, 為8.1 cM; 另有3條連鎖群包含的標記數(shù)也都超過了100, 分別是LGIV (104)、LGVII (103)和LGIII (102); 而標記數(shù)量最少的連鎖群為LGII, 僅有68個標記, 累積長度也是最小的, 僅有682.7 cM (圖3和表3)。

圖3 豌豆PSP1和PSP2整合遺傳連鎖圖譜

粗體代表錨定標記, 下畫線代表共有標記, 粗體加下畫線代表共有錨定標記。標記名稱以“e”開頭的為EST-SSR標記。

The bold, underlined and bold underlined labels on the marker name represent anchor markers, common markers and common anchor markers, respectively. Marker names started with “e” represent EST-SSR markers.

表3 豌豆整合遺傳連鎖圖譜上的標記分布

將我們的整合圖譜與以往的遺傳圖譜相比較, 結果發(fā)現(xiàn), 本研究中的7條連鎖群能夠與以往遺傳連鎖圖譜中7條連鎖群相對應[10,42-44]。通過比較整合遺傳圖譜和2個單獨的遺傳圖譜之間共有標記的順序和位置, 結果發(fā)現(xiàn), LGIV和LGVII這2個連鎖群在不同圖譜中的標記順序存在較高的共線性, 而其他連鎖群則由于作圖群體差異而觀察到了一些倒位和標記重排的現(xiàn)象。此外, 在整合圖譜的LGV上, 同時包含2個錨定標記, 一個是在以往圖譜中定位于LGV的PSGAPA1, 另一個是在以往圖譜中定位于LGI的錨定標記AD147, 因而導致LGV的定義存疑(附圖1)。

本研究以新近發(fā)表的豌豆基因組為參考(Caméor genome build 1a)[20], 對50個共有標記的擴增片段序列進行了BLAST比對分析, 從而對本文得到的遺傳圖譜和豌豆的物理圖譜相比較(附表2)。發(fā)現(xiàn)有45個標記被成功比對到豌豆的7條染色體上, 上述有爭議的1條連鎖群(LGI-2/LGV)被證明為LGV。其中30個標記具有唯一比對位置, 15個標記比對到2個以上的位置; 剩下的5個標記比對到了未掛載到染色體的組裝支架上。此外, 還比較了3個遺傳圖譜和物理圖譜的標記順序(附圖1), 發(fā)現(xiàn)chr2LG1與LGI-PSP2高度一致, chr6LG2與LGII-PSP1高度一致, chr5LG3與LGIII-Integrated map基本一致, chr4LG4與LGIV- PSP1、LGIV-PSP2和LGIV-Integrated map基本一致, chr3LG5與LGV-PSP2和LGV-Integrated map基本一致, chr1LG6與LGVI-PSP2和LGVI-Integrated map基本一致, chr7LG7與LGIV-PSP1、LGIV-PSP2和LGIV-Integrated map一致率較高。

3 討論

3.1 SSR標記篩選

由于具有多態(tài)性高、多等位基因、共顯性、可重復、可轉移和基因組覆蓋度高等特性, SSR標記包括基因組SSR和基于表達序列標簽的EST-SSR已被廣泛應用于種質資源鑒定評價、遺傳變異檢測、遺傳進化分析、遺傳連鎖圖譜構建、功能基因定位以及標記輔助育種等諸多領域[21,48-50]。通過對基因組SSR和EST-SSR的應用范圍進行比較發(fā)現(xiàn), 基因組SSR因為多態(tài)性較高更適合于區(qū)分遺傳關系比較近的基因型, 并且在指紋圖譜構建和種質資源鑒定研究中更具優(yōu)勢; 而從基因或表達序列標簽數(shù)據(jù)生成的EST-SSR標記則有利于獲得更多基因的相關信息, 在重要農(nóng)藝性狀的標記輔助選擇中具有更大優(yōu)勢, 同時在近緣物種之間具有更高的可轉移性[21,51]。以往的研究已經(jīng)成功開發(fā)了一些SSR標記[10-12,38,44], 并用于遺傳多樣性評估[1,33,52-55], 遺傳連鎖圖譜構建[10,15], 以及標記性狀關聯(lián)分析[32,56]等。然而, 豌豆作為具有重要經(jīng)濟價值和顯著生態(tài)優(yōu)勢的食用豆類作物之一, 目前具有明確定位信息同時可公開獲取的基因組SSR和EST-SSR標記數(shù)量還相對有限, 這極大地阻礙了豌豆的分子遺傳研究和標記輔助育種。在本研究中, 我們利用大規(guī)模篩選從本實驗室開發(fā)的12,491個SSR標記中得到了729個多態(tài)性SSR標記, 同時從125個已發(fā)表的具有明確遺傳圖譜定位信息的標記中篩選了25個錨定標記, 分別用于2個基于中國豌豆種質F2群體的遺傳連鎖圖譜構建和整合。在最終得到的整合遺傳圖譜中, 上圖標記達到668個, 包括509個基因組SSR、134個EST-SSR和25個錨定標記, 分布在7條連鎖群上, 對應于豌豆的7條染色體, 相關標記信息詳見附表1。這些已定位的SSR標記將為豌豆種質資源鑒定、遺傳關系分析、分子遺傳作圖以及標記輔助選擇提供寶貴資源。

3.2 遺傳連鎖圖譜構建

高密度遺傳連鎖圖譜是進行遺傳研究和分子育種的有力工具。針對豌豆的遺傳連鎖作圖已經(jīng)有很長的研究歷史, 前人利用不同的分子標記和不同的作圖群體已經(jīng)構建了許多豌豆遺傳連鎖圖譜[31]。隨著二代測序技術的發(fā)展, 基因組SSR、EST-SSR和SNP標記的高通量開發(fā)為豌豆的分子作圖奠定了重要基礎[14-18,57]。最近, 有學者還利用SRAP、SSR和SNP這3種標記基于F2群體構建了一張豌豆的遺傳連鎖圖譜, 包含128個遺傳標記, 分布在9個連鎖群上, 然后他們利用9個SSR標記作為錨定標記, 將其中的6個連鎖群與以往發(fā)表的遺傳連鎖圖譜中的連鎖群對應起來[58]。盡管在豌豆中已經(jīng)構建了超過50張的遺傳連鎖圖譜, 然而目前國際上還沒有基于SSR標記構建的標記數(shù)目達500個以上的圖譜, 因此豌豆SSR遺傳連鎖圖譜無論在標記數(shù)目和密度上均有待完善[10,15]。此外, 前人的研究已經(jīng)證明中國豌豆種質資源具有獨特的遺傳背景[1,32-33], 然而基于中國種質的豌豆遺傳連鎖圖譜很少。過去的一項研究基于中國種質構建的豌豆遺傳連鎖圖譜總長1518 cM, 僅包含157個SSR標記, 標記間平均距離為9.7 cM, 而且分布在11條連鎖群上, 與豌豆的單倍體染色體數(shù)并不一致(2= 2= 14)[15]。在本研究中, 我們首先基于與以往研究[15]相同的作圖群體(PSP1), 篩選了大量多態(tài)性SSR標記, 對以往的圖譜進行加密。加密后的圖譜累計長度擴展到5330.6 cM, 標記數(shù)目增加到603個, 標記間平均距離縮小為8.9 cM, 所有標記分布在7個連鎖群上(圖1和表2), 其中6條與以往發(fā)表的豌豆遺傳圖譜一一對應。此外, 我們還利用一個新的大樣本作圖群體(PSP2)構建了一張新的豌豆遺傳連鎖圖譜, 并通過17個錨定標記將總共118個標記定位在與以前發(fā)表的豌豆遺傳圖譜完全一致的7條連鎖群上(圖2和表2)[10]。本研究基于中國豌豆種質構建的2個作圖群體代表了與國外豌豆群體具有顯著差異的基因組背景, 得到了2個SSR遺傳連鎖圖譜, 與以往的研究相比[15], PSP1圖譜在標記數(shù)目和密度上具有明顯提高, 而PSP2在連鎖群裝配方面則具有明顯改善, 這些圖譜將為中國豌豆的標記輔助育種提供有力工具。

3.3 整合遺傳圖譜

整合圖譜憑借較高的標記數(shù)目和密度以及更完整的基因組覆蓋范圍等優(yōu)勢[34-35], 在許多作物包括豌豆中均有應用。過去幾十年, 在豌豆遺傳連鎖作圖悠久的研究歷史中, 前人已經(jīng)通過整合來自多個作圖群體的信息而獲得了很多復合遺傳連鎖圖譜[10,16,31,36-37,42,59-61]。2015年, 法國科學家利用13.2K的基因芯片對12個豌豆RIL群體進行基因分型, 同時整合了以往圖譜中的2277個標記, 構建了一個包含15,079個標記和7條連鎖群的高密度一致性連鎖圖譜, 該圖譜全長794.9 cM, 平均標記間距離0.24 cM, 為評估豌豆基因組結構、基因含量和進化歷史以及候選基因鑒定提供了有力工具[16]。然而上述一致性圖譜包含的EST-SSR和基因組SSR標記僅有187個, 為了在豌豆遺傳連鎖圖譜上積累最大數(shù)量的SSR標記, 本研究通過53個共有標記將2個F2作圖群體的數(shù)據(jù)合并構建了一個整合遺傳連鎖圖譜, 覆蓋范圍為6592.6 cM, 包括668個SSR標記(509 基因組SSR、134 EST-SSR和25個錨定標記), 分布在7條連鎖群上(圖3和表3)。值得注意的是, 遺傳連鎖圖譜的長度隨標記數(shù)目的增多而延伸, 這種現(xiàn)象在包括豌豆在內(nèi)的多個物種中均有發(fā)現(xiàn), 有人推測可能與重組事件和偏分離有關[36-37,62-64]。此外, 有學者認為延伸的圖譜長度對圖譜上標記的映射順序幾乎沒有影響[61]。過去的研究發(fā)現(xiàn), 由于多等位標記、數(shù)據(jù)缺失、偏分離和染色體重排等原因, 在比較不同雜交群體獲得的遺傳連鎖圖譜時, 會出現(xiàn)標記定位和順序的不一致[10,36-37,65]。在本研究中, 通過對2個單獨的遺傳連鎖圖譜之間53個共有標記的比較發(fā)現(xiàn), 基于2個群體構建的遺傳圖譜均可組裝到7條連鎖群上, 與以往研究中的7個連鎖群具有較好的對應關系, 然而PSP1圖譜的LGI-2 (包含LGI錨定標記AD147)對應于PSP2圖譜的LGV (包含LGV錨定標記PSGAPA1), 導致整合圖譜中LGV的不確定性(附圖1)。但是由于PSP1圖譜中7個連鎖群有6個與以往發(fā)表的圖譜一一對應, 僅剩1個連鎖群(LGI-2)因為缺乏額外的錨定標記無法與以往發(fā)表的LGV相對應; 同時PSP1圖譜中的LGI-2與PSP2圖譜中的LGV之間存在7個共有標記, 基于上述兩點原因, 我們推測LGI-2應該對應于以往發(fā)表圖譜中的LGV。然后通過對50個共有標記的擴增片段序列的BLAST比對分析, 對3個遺傳圖譜和物理圖譜進行共線性比較, 結果支持有爭議的一條連鎖群確實對應于以往遺傳圖譜中的LGV (附表2), 而該連鎖群上的錨定標記AD147可能是異位所致。另一方面, 單獨圖譜和整合圖譜共線性比較發(fā)現(xiàn), 不同圖譜在LGIV和LGVII這2個連鎖群上的標記順序具有高度一致性, 而在其他連鎖群上則觀察到標記的顛倒和錯位(附圖1), 推測這種不一致性可能是由不同作圖群體中發(fā)生的染色體重排引起的[10,36-37]。不同遺傳圖譜與物理圖譜的共線性比較得到了類似的結果(附圖1和附表2), 物理圖譜的chr4LG4和chr7LG7與3個遺傳圖譜在LGIV和LGVII這2個連鎖群上的標記順序具有較高的一致性, 說明這2條連鎖群或染色體在不同群體的親本間并未發(fā)生明顯結構變異; 物理圖譜中的chr2LG1、chr3LG5和chr1LG6與PSP2遺傳圖譜的LGI、LGV和LGVI基本一致, 而與PSP1遺傳圖譜的標記順序全部或部分相反, 說明PSP1群體的親本在這3條連鎖群或染色體上可能發(fā)生了倒位; 物理圖譜中的chr6LG2與PSP1遺傳圖譜LGII的標記順序基本一致, 而與PSP2遺傳圖譜的標記順序全部相反, 說明PSP2群體的親本在這條連鎖群或染色體上可能發(fā)生了倒位;物理圖譜中的chr5LG3與LGIII-Composite map的標記順序一致, 而與PSP1和PSP2遺傳圖譜的標記順序相反, 可能是參考基因組的豌豆基因型在該條染色體上發(fā)生了倒位或者錯誤組裝。

4 結論

利用2個基于中國豌豆種質的F2群體, 通過QTL IciMapping V4.0軟件, 整合得到一張包含7條連鎖群、668個SSR標記、總遺傳距離為6592.6 cM、平均標記密度為10 cM的豌豆遺傳連鎖圖譜。本研究將為豌豆的分子遺傳研究和標記輔助育種提供有力工具。

附表和附圖 請見網(wǎng)絡版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuow xb.aspx。

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An integrated high-density SSR genetic linkage map from two F2population in Chinese pea

LIU Rong1,**, WANG Fang1,**, FANG Li1,**, YANG Tao1, ZHANG Hong-Yan1, HUANG Yu-Ning1, WANG Dong1,3, JI Yi-Shan1, XU Dong-Xu2, LI Guan1, GUO Rui-Jun1, and ZONG Xu-Xiao1,*

1Center for Crop Germplasm Resources, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2Institute of Legumes Crop, Zhangjiakou Academy of Agricultural Sciences, Zhangjiakou 075000, Hebei, China;3Shandong Center of Crop Germplasm Resources, Jinan 250100, Shandong, China

Pea (L.) is an important food legume crop grown widely throughout the world for humans or livestock consumption. Genetic linkage map constructed with SSR markers have played a vital role in marker-assisted breeding of many crops including pea. Public available and transferable SSR markers and genetic linkage map with sufficient SSR markers based on genetically distinct Chinese pea germplasm are limited despite a long study history on genetic linkage mapping in pea. In this study, in order to obtain more transferable SSR markers and high resolution genetic linkage maps for Chinese pea, 617 polymorphic SSR markers were firstly screened from 12,491 genome-wide SSR markers and some related literatures by our laboratory, and these SSR markers were used to construct an enhanced genetic linkage map for the G0003973 × G0005527 F2population. The enhanced genetic linkage map covered 5330.6 cM in total length containing 603 SSR markers with an average inter-marker distance of 8.8 cM, which was significantly improved both in marker number and in density compared with the previous map. 119 polymorphic SSR markers were screened based on the above results to develop a new map for a large W6-22600 × W6-15174 F2population including 118 SSR markers with a cumulative length of 1127.1 cM assembled into seven genetic linkage groups. Furthermore, data from the above two genetic maps were combined to build an integrated map of 6592.6 cM, comprising 668 SSR markers, 509 genomic SSRs, 134 EST-SSRs and 25 anchor markers distributed in seven genetic linkage groups. These SSR markers and genetic linkage maps will provide a valuable tool for the genetic study and marker-assisted breeding in pea.

pea (L.); SSR; genetic linkage map; integrated map; marker-assisted breeding

10.3724/SP.J.1006.2020.04028

本研究由國家自然科學基金項目(31801428), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(CARS-08), 農(nóng)作物種質資源保護與利用專項(2019NWB036-07), 中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程, 國家農(nóng)作物種質資源共享服務平臺(NICGR2019)和國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFE0105100)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31801428), the China Agriculture Research System (CARS-08), the Crop Germplasm Resources Protection (2019NWB036-07), the Agricultural Science and Technology Innovation Program (ASTIP) in CAAS, the National Infrastructure for Crop Germplasm Resources Project from the Ministry of Science and Technology of China (NICGR2019), and the National Key Research and Development Program of China (2017YFE0105100).

宗緒曉, E-mail: zongxuxiao@caas.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

劉榮, E-mail: liurong@caas.cn; 王芳, E-mail: fwang11@huskers.unl.edu;方俐, E-mail: hathor_fang@163.com

2020-02-08;

2020-04-15;

2020-05-09.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200509.1330.002.html