魯海琴 陳 麗,2 陳 磊 張盈川 文 靜 易 斌 涂金星 傅廷棟 沈金雄,*

Bna-novel-miR311-模塊調(diào)控甘藍(lán)型油菜響應(yīng)熱脅迫的機(jī)制

魯海琴1陳 麗1,2陳 磊1張盈川1文 靜1易 斌1涂金星1傅廷棟1沈金雄1,*

1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 國(guó)家油菜工程技術(shù)研究中心, 湖北武漢 430070;2長(zhǎng)江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院, 重慶 408100

HSP70 (heat shock protein 70)參與植物熱脅迫應(yīng)答, 增強(qiáng)植物耐熱性, 但目前油菜中尚無(wú)miRNA調(diào)控基因的報(bào)道。本研究novel-miR311是利用高通量技術(shù)在甘藍(lán)型油菜莖尖中篩選出的新miRNA。novel-miR311存在于油菜而不存在于擬南芥中, 5￠-RACE技術(shù)證實(shí)其2個(gè)靶基因?qū)贌釕?yīng)激同源蛋白基因(家族), 在甘藍(lán)型油菜體內(nèi)被剪切。構(gòu)建novel-miR311超表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)化擬南芥和甘藍(lán)型油菜, 其轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗中基因表達(dá)量顯著下降。高溫脅迫試驗(yàn)表明, 擬南芥和甘藍(lán)型油菜熱脅迫后, 其陽(yáng)性苗的生長(zhǎng)勢(shì)和存活率顯著低于其對(duì)應(yīng)的對(duì)照。qPCR結(jié)果顯示, 油菜中基因表達(dá)量熱脅迫后較熱脅迫前上升。上述結(jié)果表明, 油菜novel-miR311介導(dǎo)基因的剪切降低了擬南芥和甘藍(lán)型油菜耐熱性。

甘藍(lán)型油菜; 擬南芥; novel-miR311;; 高溫脅迫

近年來(lái), 極端高溫天氣頻繁發(fā)生, 導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)嚴(yán)重。高溫誘導(dǎo)下, 植物產(chǎn)生抵抗高溫的蛋白進(jìn)行防御, 如熱休克蛋白HSP70 (heat shock protein 70)等, 其作為分子伴侶協(xié)助植物抵抗高溫脅迫的影響[1-2]。HSP70家族蛋白高度保守, 主要有2個(gè)功能區(qū), 與ATP結(jié)合并使其水解的核酸結(jié)合區(qū)(nucleotide binding domain, NBD)和底物結(jié)合區(qū)(substrate binding domain, SBD), 其行使功能需DnaJ (DnaJ like protein)和NEF (nucleotide exchange factor) 2類蛋白參與。首先HSP40 (DnaJ)通過(guò)其J結(jié)構(gòu)域識(shí)別底物, 并將底物傳遞到HSP70; HSP70水解ATP后, 與底物結(jié)合并對(duì)底物進(jìn)行修飾; 隨后NEF (HSP110)與HSP70的NBD區(qū)結(jié)合, 促進(jìn)ADP釋放; 當(dāng)新的ATP與HSP70結(jié)合, HSP110從HSP70上脫離, 且釋放加工好的底物[3-6]。

MicroRNA (miRNA)是一類長(zhǎng)度為20~24 nt具有重要功能的單鏈小分子RNA, 其為基因表達(dá)負(fù)調(diào)控因子, 最終以RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)行使其對(duì)靶基因的切割和抑制翻譯等功能[7]。直到2002年才首次在植物中發(fā)現(xiàn)miRNA[8], 后續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn), miRNA參與調(diào)控植物生命活動(dòng)的多個(gè)過(guò)程, 包括植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素應(yīng)答、營(yíng)養(yǎng)元素的攝取與利用、以及多種生物與非生物脅迫[9-15]。參與響應(yīng)植物熱脅迫的miRNA也相繼被報(bào)道, 其中主要是植物熱脅迫下鑒定響應(yīng)高溫的miRNA, 如小麥高溫脅迫下利用高通量技術(shù)鑒定響應(yīng)熱脅迫的miRNA[16], 玉米和番茄高溫脅迫下鑒定高溫相關(guān)的miRNA[17-19]。只有少數(shù)報(bào)道具體某個(gè)miRNA如何響應(yīng)高溫脅迫, 如番茄中過(guò)表達(dá)sha-miR319d提高其耐熱性[20]; 過(guò)量表達(dá)miR160和miR157都增加棉花對(duì)高溫脅迫的敏感性[21]; 紫花苜蓿和擬南芥中超表達(dá)miR156, 其耐熱性都獲得提高[22-23]。油菜是我國(guó)重要的食用植物油來(lái)源之一, 市場(chǎng)需求巨大[24], 然而油菜中響應(yīng)熱脅迫的miRNA研究報(bào)道尚少, 其中主要是油菜熱脅迫下鑒定響應(yīng)高溫的miRNA, 如芥菜型和白菜型油菜高溫脅迫下鑒定響應(yīng)熱脅迫的miRNA[25-26], 其具體應(yīng)對(duì)高溫脅迫的機(jī)制尚不清楚。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得甘藍(lán)型油菜中新miRNA (novel-miR311), 揭示其在擬南芥和甘藍(lán)型油菜熱脅迫時(shí)通過(guò)切割, 使本應(yīng)大量產(chǎn)生的HSC70-1蛋白不能大量產(chǎn)生, 從而導(dǎo)致擬南芥和甘藍(lán)型油菜耐熱性降低, 以期為油菜抗高溫育種提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

測(cè)序用的材料來(lái)源于甘藍(lán)型油菜正常株型品系08-8008和矮稈突變體4942C-5 (輪回親本)構(gòu)建的回交BC5群體(取其中的矮稈緊湊單株和正常株型單株各8株, 抽薹初期取莖頂端組織分別混樣, 2次重復(fù)); 轉(zhuǎn)基因受體材料為甘藍(lán)型油菜品種J572和哥倫比亞型擬南芥(); 5￠-RACE文庫(kù)的供試材料為矮稈緊湊突變體4942C-5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 5￠-RACE文庫(kù)構(gòu)建和5￠-RACE驗(yàn)證靶基因切割位點(diǎn) 利用GeneRacer kit (Invitrogen, USA)試劑盒構(gòu)建5￠-RACE文庫(kù)。流程如下: 取矮稈緊湊突變體4942C-5莖尖提取總RNA, 取5 μg總RNA不經(jīng)過(guò)脫磷酸化處理和去帽子處理直接連RNA接頭, 用SuperScript III反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。靶基因切割位點(diǎn)驗(yàn)證: 以5￠-RACE文庫(kù)為模板, 通過(guò)兩輪Touchdown PCR擴(kuò)增, 獲得目標(biāo)大小片段, 通過(guò)TA克隆把PCR產(chǎn)物連接到PGEM-Teasy載體上測(cè)序, 最終確定目標(biāo)mRNA精確的剪切位點(diǎn)。具體步驟和PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照陳麗[27]。

1.2.2 novel-miR311超表達(dá)載體的構(gòu)建 將novel-miR311前體與NCBI甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)尋到前體的側(cè)翼序列, 為保證miRNA前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)能夠在體內(nèi)正確轉(zhuǎn)錄并切割, 選取莖環(huán)結(jié)構(gòu)前后各-200 bp左右側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物。利用超表達(dá)載體pS2300 (由本實(shí)驗(yàn)室趙倫博士提供)連接novel-miR311前體序列轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)挑取單克隆測(cè)序, 以序列正確的單克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(GV3101)。

1.2.3 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 利用農(nóng)桿菌蘸花法進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行培養(yǎng), 采用花序浸花法侵染野生型擬南芥植株。將所收種子干燥春化后消毒播于50 μg mL-1卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上, 置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)10 d左右, 挑取生長(zhǎng)嫩綠且有根的植株移栽于溫室培養(yǎng), 進(jìn)行后續(xù)鑒定。

1.2.4 油菜的遺傳轉(zhuǎn)化 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行油菜遺傳轉(zhuǎn)化, 方法參考陳麗[27]。

1.2.5 陽(yáng)性苗鑒定 取得到的轉(zhuǎn)基因油菜和擬南芥幼苗葉片, 用CTAB (hexadecyl trimethyl ammoni um bromide, 十六烷基三甲基溴化銨)法提取基因組DNA。以提取的DNA為模板, 一條載體上的引物, 一條基因內(nèi)部的引物, 本研究中目的片段長(zhǎng)度為456 bp。PCR體系包含1 μL模板、3 μL ddH2O、引物各0.5 μL、5 μL PCR Mix (擎科)。PCR程序?yàn)?4℃ 3 min; 94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 1 min, 共32個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.6 RNA提取 采用TRIzol Reagent法[27]抽提總RNA。

1.2.7 miRNA和靶基因的反轉(zhuǎn)錄及定量PCR

參照Varkonyi-Gasic等[28]設(shè)計(jì)miRNA的RT-PCR (reverse transcription PCR)引物。在Bio-Rad CFX96儀器上進(jìn)行miRNA和靶基因的qPCR (quantitative real-time PCR)反應(yīng), miRNA以U6作為內(nèi)參, 靶基因以基因作為內(nèi)參。miRNA和靶基因的RT-PCR和qPCR具體方法參照陳麗[27]。使用2 delta-delta Ct方法[29]計(jì)算miRNA和基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)變化。

1.2.8 高溫脅迫處理 參照Leng等[30]的方法并略作修改進(jìn)行擬南芥高溫脅迫處理。挑選健壯的擬南芥轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系和野生型種子, 使用75%的酒精清洗1 min, 后以0.1%升汞洗8~10 min, 再以無(wú)菌水洗3~4遍, 每遍4~5 min, 將晾干的種子播到1/2 MS培養(yǎng)基上, 光照培養(yǎng)室(16 h光照/8 h黑暗, 溫度23℃, 濕度60%)生長(zhǎng)10 d左右后, 置于光照培養(yǎng)箱(只有溫度改變, 其他條件不變)進(jìn)行42℃ 4 h培養(yǎng), 放回光照培養(yǎng)室培養(yǎng)7 d后, 觀察表型并照相。

油菜種子高溫脅迫后發(fā)芽試驗(yàn): 分別挑取健壯圓潤(rùn)的轉(zhuǎn)基因油菜陽(yáng)性苗和對(duì)照J(rèn)572的種子100粒, 用錫箔紙包好, 分別將種子進(jìn)行4℃ 2 h、37℃ 2 h、4℃ 2 h–室溫1 h–70℃ 2 h、37℃ 2 h–室溫1 h–70℃2 h和70℃ 2 h處理, 不經(jīng)高溫處理為對(duì)照。將用錫箔紙包好的種子分別置于恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行37℃處理、4℃冰箱進(jìn)行4℃處理以及烘箱中進(jìn)行70℃處理。處理后的種子擺入裝有2層濾紙的10×10的培養(yǎng)方皿中, 置于光照培養(yǎng)室(16 h光照/8 h黑暗, 溫度23℃, 濕度60%)中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn), 期間向培養(yǎng)方皿中不定時(shí)加水。

油菜幼苗高溫試驗(yàn): 挑取健壯的轉(zhuǎn)基因油菜陽(yáng)性苗和對(duì)照J(rèn)572的種子, 同時(shí)播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土10×10的缽子里, 播種完將其置于油菜溫室(溫室條件與上述光照培養(yǎng)室一致)培養(yǎng)10 d左右(長(zhǎng)出2片小真葉), 隨后在光照培養(yǎng)箱(除溫度外, 其他條件與油菜溫室一致)進(jìn)行43℃ 5 h、44℃ 5 h和45℃ 5 h培養(yǎng), 處理后再置于原油菜溫室培養(yǎng)7 d后觀察表型并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bna-novel-miR311及其靶基因

通過(guò)回交群體中矮稈緊湊型單株和正常株型單株混池的小RNA高通量測(cè)序, 在2種材料池中都鑒定到novel-miR311和其前體序列, 與擬南芥基因組比較, 發(fā)現(xiàn)它們僅在油菜中存在。利用MFOLD軟件對(duì)novel-miR311前體序列進(jìn)行折疊發(fā)現(xiàn), 其可形成完美的發(fā)夾結(jié)構(gòu), 利于被Dicer-like (DCL1)酶切割, 且其最小折疊自由能為dG =-65.61 kJ mol-1, 符合miRNA的特征小于-18 kJ mol-1。

同時(shí)通過(guò)對(duì)上述2種材料池的降解組測(cè)序鑒定到被novel-miR311剪切的10個(gè)候選靶基因, 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 其中8個(gè)靶基因?yàn)榧易寤?5個(gè)為熱應(yīng)激同源蛋白基因, 3個(gè)為熱誘導(dǎo)型蛋白基因); 另外2個(gè)靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族基因(表1)。5￠-RACE驗(yàn)證和()被novel-miR311切割(圖1)。

表1 novel-miR311降解組測(cè)序預(yù)測(cè)到的10個(gè)候選靶基因

圖1 5￠-RACE驗(yàn)證靶基因

冒號(hào)表示堿基配對(duì), 點(diǎn)號(hào)表示錯(cuò)配, 箭頭表示切割位點(diǎn), 數(shù)字表示挑斑克隆。

“:” represents the miRNA and its targets are labeled on the right, “.” represents mismatch, the arrow indicates the cleavage site, and the numbers above sequences represent the detected cleavage site of independent clones.

2.2 Bna-novel-miR311候選靶基因與其在擬南芥中的同源基因

利用NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)油菜中的10個(gè)候選靶基因和其在擬南芥基因組中的同源基因的序列相似度比較分析發(fā)現(xiàn), novel-miR311在油菜中的所有靶基因與其在擬南芥中的同源基因都有85%以上的相似度, 且油菜中10個(gè)靶基因的靶標(biāo)位點(diǎn)與擬南芥中的同源基因相差無(wú)幾, 特別是基因的靶序列在油菜和擬南芥中毫無(wú)差別(圖2)。這一結(jié)果說(shuō)明novel-miR311存在結(jié)合擬南芥中靶基因并進(jìn)行靶標(biāo)作用的可能, 故構(gòu)建novel-miR311超表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)化擬南芥和油菜。

(圖2)

a: 轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白基因; b: 熱激蛋白基因; c:熱應(yīng)激同源蛋白基因。紅色部分為novel-miR311與靶基因結(jié)合部位。

a: transduction protein gene; b: heat shock proteingene; c: heat shock cognate proteingene. The red part is the binding site of novel-miR311 and target gene.

2.3 Bna-novel-miR311在擬南芥高溫脅迫中的功能驗(yàn)證

2.3.1 Bna-novel-miR311及其靶基因在擬南芥組織中的表達(dá)分析 選取3個(gè)陽(yáng)性擬南芥轉(zhuǎn)基因株系, 分別檢測(cè)novel-miR311及基因在其根、莖、葉、花和角果的表達(dá)量, 以野生型作為對(duì)照。野生型擬南芥中, 5個(gè)組織幾乎全都檢測(cè)不到novel-miR311的表達(dá), 與擬南芥基因組中無(wú)novel-miR311前體序列相符合; 而基因的表達(dá)量在野生型中顯著高于陽(yáng)性株系(圖3)。說(shuō)明novel-miR311對(duì)擬南芥中與油菜的同源靶基因進(jìn)行切割。

圖3 野生型和陽(yáng)性擬南芥中novel-miR311和HSC70-1分別在根、莖、葉、花和角果中的表達(dá)量

每次試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)。*和**分別表示< 0.05和< 0.01。

Data are shown as mean ± SD of three biological replicates. * and ** represent< 0.05 and< 0.01, respectively.

2.3.2 高溫脅迫前后擬南芥陽(yáng)性株系的表型觀察

選取3個(gè)T3代擬南芥轉(zhuǎn)基因株系和野生型進(jìn)行高溫脅迫試驗(yàn), 經(jīng)幾批預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 42℃ 4 h處理下出現(xiàn)較明顯的表型。圖4-a方皿中擬南芥左半邊為陽(yáng)性苗, 右半邊為野生型。novel-miR311 (N311)陽(yáng)性苗的3個(gè)株系經(jīng)42℃4 h處理后, 生長(zhǎng)勢(shì)和存活率顯著低于野生型擬南芥。每個(gè)株系中熱脅迫后陽(yáng)性苗生長(zhǎng)不受影響的百分比顯著低于野生型, 而死亡百分比高于野生型(圖4)。

2.4 Bna-novel-miR311在甘藍(lán)型油菜高溫脅迫中的功能驗(yàn)證

2.4.1 高溫脅迫前后油菜陽(yáng)性株系種子的發(fā)芽分析

選取3個(gè)T1代油菜轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照J(rèn)572種子進(jìn)行高溫脅迫后的發(fā)芽試驗(yàn)。經(jīng)4℃ 2 h、37℃ 2 h處理與不經(jīng)高溫處理在第2天的發(fā)芽率無(wú)顯著差異; 經(jīng)4℃ 2 h–室溫1 h–70℃ 2 h、37℃ 2 h–室溫1 h–70℃ 2 h和70℃ 2 h處理較不經(jīng)高溫處理在第2天的發(fā)芽率顯著降低, 但對(duì)照J(rèn)572的發(fā)芽率顯著高于油菜轉(zhuǎn)基因株系, 且經(jīng)過(guò)一段時(shí)間低溫訓(xùn)練后再進(jìn)行70℃高溫處理較直接進(jìn)行70℃高溫處理的發(fā)芽率稍高(圖5) (正常發(fā)芽的種子: 雙子葉圓粒種子幼根達(dá)種子直徑長(zhǎng))。

2.4.2 高溫脅迫前后油菜陽(yáng)性株系的表型觀察

選取4個(gè)T1代novel-miR311 (N311)株系轉(zhuǎn)基因油菜和對(duì)照J(rèn)572進(jìn)行熱脅迫試驗(yàn), 圖5-a所有缽子中左邊為油菜轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗, 右邊為J572。由于轉(zhuǎn)基因油菜種子數(shù)量的原因, 43℃ 5 h處理只有2個(gè)重復(fù), 44℃ 5 h處理和45℃ 5 h處理有4個(gè)重復(fù)。

處理前轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照J(rèn)572植株生長(zhǎng)勢(shì)并無(wú)差別(圖6-a), 經(jīng)43℃ 5 h處理溫室再培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)基因植株較J572明顯矮小; 經(jīng)44℃ 5 h處理, 所有轉(zhuǎn)基因植株全部死亡, 而在N311-6和N311-63的缽子中對(duì)應(yīng)的J572分別存活2株和1株; 經(jīng)45℃ 5 h處理, 所有油菜全部死亡。qPCR結(jié)果顯示, 無(wú)論是熱脅迫前還是熱脅迫后, 油菜陽(yáng)性苗體內(nèi)novel-miR311的表達(dá)量較J572顯著上調(diào), 其靶基因顯著下調(diào), 而44℃處理后所有株系中novel-miR311的表達(dá)量較處理前略微下降, 而靶基因上升(圖6-b)

圖4 野生型和陽(yáng)性擬南芥在1/2MS上的高溫脅迫實(shí)驗(yàn)

a: 表型分析; b: 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。a: phenotypic analysis; b: statistical analysis.

(圖5)

a: 不同溫度處理前后對(duì)比圖; b: 2 d發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)圖。

a: comparison chart before and after treatment at different temperatures; b: germination rate chart for two days.

3 討論

3.1 Bna-novel-miR311及其靶基因

novel-miR311是利用高通量測(cè)序在油菜莖尖中發(fā)現(xiàn)的新miRNA, 降解組測(cè)序預(yù)測(cè)其靶基因?yàn)闊峒さ鞍准易?。序列比?duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn), novel-miR311存在于油菜而不存在于擬南芥中, 且novel-miR311的10個(gè)靶基因與其在擬南芥中同源基因相似度非常高, 特別是在靶序列處相似度更高, 故而保證novel-miR311在擬南芥中切割其靶基因的可能。5￠-RACE技術(shù)驗(yàn)證油菜中2個(gè)靶基因和()被novel-miR311切割, 因此構(gòu)建novel-miR 311超表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)化擬南芥和油菜。

3.2 Bna-novel-miR311在響應(yīng)擬南芥高溫脅迫途徑中的作用

qPCR分析發(fā)現(xiàn), 擬南芥陽(yáng)性苗中novel-miR311表達(dá)量均顯著高于野生型, 而其靶基因顯著低于野生型, 說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)novel-miR311表達(dá)量水平上升, 且在體內(nèi)對(duì)其靶基因切割。值得一提的是, 野生型擬南芥中幾乎檢測(cè)不到novel-miR311, 符合novel-miR311前體序列在擬南芥基因組中比對(duì)不上的結(jié)果。

novel-miR311的靶基因?yàn)闊峒さ鞍准易寤? 而HSP70蛋白作為分子伴侶在植物遭受逆境脅迫時(shí)協(xié)助產(chǎn)生的變性蛋白質(zhì)再折疊, 防止變性蛋白質(zhì)聚集, 并溶解或降解蛋白質(zhì)聚體[31-32]。熱激因子(heat shock factor, HSF)與熱脅迫產(chǎn)生的變性蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HSP70, 變性蛋白更易結(jié)合HSP70, 使得鈍化態(tài)HSF單體解離, 解離的HSF單體形成活化態(tài)HSF三聚體, 再次結(jié)合到基因上游促進(jìn)其大量產(chǎn)生[33-34]。

本研究利用擬南芥進(jìn)行高溫、干旱和鹽脅迫的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 只有高溫脅迫后出現(xiàn)較明顯的轉(zhuǎn)novel-miR311陽(yáng)性苗存活率顯著低于野生型的表型。同時(shí)有研究表明, 擬南芥中過(guò)量表達(dá)基因提高其耐熱性[35-36], 而此結(jié)果與本研究中的擬南芥熱脅迫試驗(yàn)結(jié)果正好對(duì)應(yīng)。說(shuō)明當(dāng)轉(zhuǎn)基因擬南芥遭受熱脅迫時(shí), 由于novel-miR311對(duì)基因的切割, 從而影響其翻譯的蛋白修飾損傷蛋白的功能, 進(jìn)一步導(dǎo)致擬南芥陽(yáng)性苗熱脅迫后死亡率升高。因此novel-miR311通過(guò)影響擬南芥中HSP70的作用途徑, 使其不能大量產(chǎn)生HSP70蛋白, 從而影響因高溫產(chǎn)生變性蛋白的修復(fù), 進(jìn)而造成轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性降低(圖7)。

3.3 Bna-novel-miR311在響應(yīng)油菜高溫脅迫途徑中的作用

研究表明油菜受熱脅迫時(shí)誘導(dǎo)HSP70大量產(chǎn)生[37], 煙草中超表達(dá)油菜基因提高其耐熱性[38]。本研究發(fā)現(xiàn)熱脅迫后, 轉(zhuǎn)基因油菜的生長(zhǎng)勢(shì)和存活率顯著低于J572, qPCR結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)基因油菜中novel-miR311表達(dá)量顯著高于J572, 而基因的表達(dá)量整體上熱脅迫后高于脅迫前, 但無(wú)論脅迫前還是脅迫后其陽(yáng)性苗中基因的表達(dá)量都顯著低于對(duì)照J(rèn)572, 說(shuō)明熱脅迫后油菜中基因的表達(dá)量上升, 但因油菜陽(yáng)性苗相對(duì)J572體內(nèi)上升的novel-miR311對(duì)其靶基因真實(shí)切割, 導(dǎo)致熱脅迫后基因大量產(chǎn)生, 結(jié)合轉(zhuǎn)基因油菜種子高溫處理后的2 d發(fā)芽率顯著低于對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果, 說(shuō)明novel-miR311也可影響油菜熱脅迫后HSP70的大量產(chǎn)生而影響HSP70的作用途徑。該結(jié)果完善了高溫脅迫下植物體內(nèi)HSP70的作用途徑, 也為油菜抗高溫研究提供了新思路。

圖6 甘藍(lán)型油菜陽(yáng)性苗與J572在土壤中的高溫脅迫表型及表達(dá)分析

a:熱脅迫前后陽(yáng)性苗與J572的對(duì)比圖, 圖中紅色箭頭指存活的油菜。b:熱脅迫前后novel-miR311和的表達(dá)量。每次試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)。**表示< 0.01。

a: comparison of positive seedlings and J572 before and after heat stress, the red arrow in figures refers to the surviving rapeseed. b: expression of novel-miR311 andbefore and after heat stress. Data are shown as mean ± SD of three biological replicates. **< 0.01.

圖7 HSP70作用途徑

根據(jù)Jacob等[33]并略作修改, 虛框中為引入本文結(jié)果。

According to Jacob et al.[33]with slight modification, the results in the dashed box are for the introduction of this article.

本研究中轉(zhuǎn)基因油菜和擬南芥熱脅迫后的表型都不是非常明顯, 可能是處理的條件需再探究; 高溫脅迫時(shí)的幼苗大小也是影響最后結(jié)果的原因之一; 高溫脅迫時(shí)植物大量產(chǎn)生的HSP70家族蛋白不僅有HSC70-1, 還有其他類型, 其他類型的HSP70蛋白也行使修飾損傷蛋白的功能。

4 結(jié)論

本研究鑒定到油菜novel-miR311, 其在擬南芥與油菜中真實(shí)切割。novel-miR311在擬南芥和油菜高溫脅迫中因切割影響其翻譯的蛋白行使修飾損傷蛋白的功能, 從而導(dǎo)致高溫脅迫后擬南芥和油菜陽(yáng)性苗耐熱性降低。

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附表1 novel-miR311的前體和成熟體序列

Supplementary table 1 novel-miR311 precursor sequence and mature sequence

類別Type序列Sequence (5￠-3￠) 成熟體Mature sequence (5′–3′)TTGGTGATAATTGGATTGGCA 前體Precursor sequence (5′–3′)TATGTGGTTAGAGCCAATCCATTTATCACCAATTCGTTTAAGTTGGTATAAATGTCGGTTTAAGAGCGATCAGGCCTATCAAAAATAGGCCGGATCGAATTCTGTTCAGTTGGGCAAGGTGTGTTTGTGCTCTGATACCATGATAAATTTCTTAGTTTTACAATTAAAACTAATTGGTGATAATTGGATTGGCACGTCCCTAAC 引物Primer (5′–3′)5' primer: AACTGCAGTTGTAGTTTTGAGAGATTAGAAGTGG3' primer: CGGGATCCCTTTTATTAATCCCTCAGTAATACACC

附圖1 novel-miR311莖環(huán)結(jié)構(gòu)

Supplementary Fig. 1 novel-miR311stem-loop structure

Mechanism research of Bna-novel-miR311-module regulating heat stress response inL.

LU Hai-Qin1, CHEN Li1,2, CHEN Lei1, ZHANG Ying-Chuan1, WEN Jing1, YI Bin1, TU Jing-Xing1, FU Ting-Dong1, and SHEN Jin-Xiong1,*

1National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / National Engineering Research Center of Rapeseed, Huazhong Agriculatural University, Wuhan 430070, Hubei, China,2School of Advanced Agriculture and Bioengineering, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China

HSP70 (heat shock protein 70) participates in the response to heat stress, and can enhance plant heat tolerance, but there have been no reports of miRNA regulatingin rapeseed. In this study, a new miRNA, named novel-miR311, was identified in the shoot tip ofby high-throughput technology. novel-miR311 was present inbut not in, and 5￠-RACE technology confirmed that its two target genes, belonged to heat stress homologous protein gene(family), and could be cleavaged in. An overexpression vector of novel-miR311 was constructed and transformed intoand, and the expression ofin transgenic positive seedlings was decreased significantly. High temperature stress experiments showed that the growth potential and survival rates ofandpositive seedlings were lower than those of their corresponding controls. The qPCR results showed that the expression ofgene in rapeseed increased after heat stress than before stress. In conclusion, the results suggest that Bna- novel-miR311 could reduce the heat resistance ofandby mediating cleavaged of.

;; novel-miR311;; high temperature stress

10.3724/SP.J.1006.2020.04014

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571698)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31571698).

沈金雄, E-mail: jxshen@mail.hzau.edu.cn, Tel: 027-87281507

E-mail: 857929189@qq.com

2020-01-16;

2020-06-02;

2020-06-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200622.1119.004.html