王 磊,趙 穎,劉紅星,2

（1.河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院,河北三河 065201；2.北京陸道培血液病研究院，北京 100176）

環(huán)孢素A（cyclosporine A,CsA）是由11 個(gè)氨基酸水合而成的親脂性環(huán)狀多肽，是一種具有高選擇性的強(qiáng)效免疫抑制劑，為拮抗臨床器官和組織移植后排異反應(yīng)的首選藥物[1]。在骨髓移植患者中，主要用于骨髓移植排異和移植物抗宿主反應(yīng)（graft versus host reaction,GVHD）的預(yù)防和治療[1-6]，其使用周期長，應(yīng)用頻率高，但其具有治療窗窄，個(gè)體差異大，須進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)[2-7]。目前，CsA 血藥濃度測(cè)定方法主要有免疫法（EIA，EMIT，MEIA，CMIA，Elecsys 等）、色譜法及質(zhì)譜法[2-15]。由于免疫法易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果偏離，同時(shí)其試劑價(jià)格昂貴；色譜法分析時(shí)間長，限制了大樣本的臨床檢測(cè)對(duì)血藥濃度檢測(cè)及時(shí)性的要求，因此質(zhì)譜法檢測(cè)CsA 血藥濃度越來越受到廣大實(shí)驗(yàn)室的 。因此，本文根據(jù)臨床需求結(jié)合醫(yī)院實(shí)際情況，在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有三臺(tái)不同型號(hào)質(zhì)譜儀（TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD）上分別進(jìn)行CsA 血藥濃度測(cè)定的方法學(xué)性能確證[16-20]，找出CsA 血藥濃度測(cè)定在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有哪款質(zhì)譜儀上性能更穩(wěn)定，檢測(cè)更方便，且更適合大批量臨床樣本檢測(cè)。通過臨床實(shí)際樣本檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)同一批樣本分別在三臺(tái)質(zhì)譜儀上檢測(cè)結(jié)果之間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，優(yōu)選出合適的質(zhì)譜儀用于CsA 血藥濃度測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2019年11月24日～ 25日送河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院藥理室檢測(cè)CsA 血藥濃度的新鮮剩余全血樣本，共100 份。要求血樣無黃疸、無乳糜、無溶血及凝血，樣本剩余全血量不小于2ml。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 ：TRIPLE QUADTM 4500 MD 質(zhì) 譜儀（美國Sciex 公司），Jasper 高效液相色譜儀，4000 Q TRAP質(zhì)譜儀（美 國AB Sciex 公 司），島津 20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司），API 3200 MD 質(zhì)譜儀（美國AB sciex 公司），島津Nexera Xp 型高效液相色譜儀（日本島津公司）。其它儀器有渦旋振蕩器，離心機(jī)等。

1.2.2 試 劑：ClinCal?-Calibrator（RECIPE，CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)，ClinChek?-Control（RECIPE，CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)；CsA 測(cè)定試劑盒（紅細(xì)胞裂解液和CsA-d4 內(nèi)標(biāo)液及CsA 標(biāo)準(zhǔn)液；批號(hào)20191111，江蘇豪思生物科技有限公司）。甲醇為色譜純（Fisher）,水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏），甲酸為色譜純（Fisher），乙酸銨（AR，MREDA TECHNOLOGY INC）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱Ultimate XB-C18 色譜柱（4.6mm×50mm，5μm），柱溫60℃；流速0.8ml/min；流動(dòng)相：2mmol/L 乙酸銨-0.1%甲酸水溶液（B）-0.1%甲酸甲醇溶液（A）。

表1 不同質(zhì)譜儀上的色譜條件

1.3.2 質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源（ESI+）； MRM；碰撞氣：Medium。

表2 三臺(tái)質(zhì)譜儀的主要質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 前處理方法：精密吸取100μl 全血置于1.5ml EP 管中，然后依次加入紅細(xì)胞裂解液100μl，CsA-d4 內(nèi)標(biāo)液300μl，渦旋震蕩1.0min，13 000r/min離心8min，取上清液150μl于自動(dòng)進(jìn)樣器，待檢。ClinCal?-Calibrator 和ClinChek?-Control 處理方法同上。

1.3.4 性能確證[16-20]

1.3.4.1 方法學(xué)考察：在上述色譜質(zhì)譜條件下，取空白全血100μl，用300μl 的50%甲醇代替內(nèi)標(biāo)液，按照“1.3.3”項(xiàng)下處理；另取100μl 空白全血加一定量CsA 標(biāo)準(zhǔn)液，余下按照“1.3.3”項(xiàng)下處理；另取100μl 患者樣品全血按照“1.3.3”項(xiàng)下處理方法處理。根據(jù)三組樣品的出峰情況，對(duì)本實(shí)驗(yàn)的方法學(xué)進(jìn)行考察。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別在7 個(gè)1.5ml 的EP 管中加入100μl ClinCal?-Calibrator各系列校準(zhǔn)工作液，按“1.3.3”處理后進(jìn)行檢測(cè)，用加權(quán)（W=1/X2）最小二乘法以CsA 峰面積與CsA-d4 峰面積比值為(Y)對(duì)CsA 濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得CsA 標(biāo)準(zhǔn)曲線。以平均信噪比（S/N）為3 的濃度作為方法的最低檢測(cè)線（limit of detection，LOD），以平均信噪比（S/N）為10 的濃度作為方法的最低定量線（limit of quantitation，LOQ）。

1.3.4.3 精密度和正確度：按“1.3.3”樣品處理辦法，對(duì)ClinChek?-Control 每一濃度平行制備6 個(gè)樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 天，根據(jù)測(cè)得結(jié)果計(jì)算日內(nèi)及日間精密度和回收率。

1.3.4.4 殘留和基質(zhì)效應(yīng)：通過分析高濃度樣品或校準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)濃度樣品后，立即測(cè)定空白樣品來評(píng)價(jià)方法殘留，測(cè)定空白基質(zhì)樣品中的CsA 和內(nèi)標(biāo)CsA-d4 的峰面積，以確認(rèn)殘留對(duì)CsA 準(zhǔn)確定量的影響；基質(zhì)效應(yīng)是通過評(píng)價(jià)CsA 在有無全血基質(zhì)中的信號(hào)值強(qiáng)弱來實(shí)現(xiàn)的，分別添加3 個(gè)濃度水平的CsA ClinChek?-Control 質(zhì)控溶液到全血基質(zhì)和純?nèi)軇?，按照?.3.3”樣品處理辦法處理，通過比較全血存在下CsA 及CsA-d4 的信號(hào)強(qiáng)度與不含全血CsA 及CsA-d4 的信號(hào)強(qiáng)度，通過內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子(IS-normalized MF)來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，計(jì)算公式如下：

IS-normalized MF =（基質(zhì)存在下CsA 峰 面積/CsA-d4 面積）/（基質(zhì)不存在下CsA 峰面積/CsA-d4 峰面積）

1.3.4.5 穩(wěn)定性：由于CsA 血藥濃度檢測(cè)要求及時(shí)性，故對(duì)ClinChek?-Control 低、中、高濃度樣品分別進(jìn)行室溫放置24h 后分析，4℃冰箱放置24h 后分析，每個(gè)濃度五份樣品，按照“1.3.3”項(xiàng)下進(jìn)行ClinChek?-Control 質(zhì)控品處理。如果重復(fù)性測(cè)定的偏倚不超過±15%，則樣品的穩(wěn)定性符合實(shí)驗(yàn)室臨床檢測(cè)的要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 收集的100 份患者CsA 血藥濃度剩余全血樣本，按“1.3.3”項(xiàng)下處理，分別在三臺(tái)質(zhì)譜儀上檢測(cè)其CsA 濃度。使用SPSS 17.0 對(duì)三臺(tái)儀器檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差分析，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)對(duì)三臺(tái)儀器檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果 見圖1。在選用條件下，全血中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾CsA 和CsA-d4 的測(cè)定，CsA 在TRIPLE QUADTM 4500 MD，4000 Q TRAP和API 3200 MD出峰時(shí)間分別為1.95，1.95 和1.99min，各峰型良好，CsA-d4 與CsA 保持一致。TRIPLE QUADTM 4500 MD 和4000 Q TRAP 每針檢測(cè)時(shí)間為3min；API 3200 MD 每針檢測(cè)時(shí)間為4min，耗時(shí)較長，檢測(cè)速度慢。

圖1 方法學(xué)考察（A，B，C）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 見表3。表明CsA 在濃度區(qū)間（26.4 ng/ml ～ 1 290 ng/ml）內(nèi)，在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 質(zhì)譜儀上的線性關(guān)系良好，均可用于定量；其LOD 分別為0.5，0.2，0.6 ng/ml；其LQD 分別為1.7，0.7，2.1 ng/ml。

表3 不同型號(hào)質(zhì)譜儀標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.3 精密度和準(zhǔn)確度 見表4。CsA 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD上的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小（＜5%），精密度好，回收率高(＞90%)，準(zhǔn)確度好。說明此三臺(tái)質(zhì)譜儀上的CsA 檢測(cè)方法均能滿足患者CsA 血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)精密度和準(zhǔn)確度的要求。

表4 三臺(tái)質(zhì)譜儀精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果

2.4 殘留、基質(zhì)響應(yīng)結(jié)果 殘留結(jié)果見表5，CsA和 內(nèi) 標(biāo)CsA-d4 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三臺(tái)質(zhì)譜儀上殘留結(jié)果均小于5%，符合中國藥典藥品生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[16]。

基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表6，表明有全血、無全血基質(zhì)中加入不同濃度CsA 在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三 臺(tái) 質(zhì) 譜 儀上的IS-normalized MF 分別為94.96%～ 106.02%，88.96% ～ 95.47%和99.14%～ 107.82%，偏倚（CV）均小于15%，說明內(nèi)標(biāo)與分析物的基質(zhì)效應(yīng)接近，可以補(bǔ)償樣品中分析物可能出現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)符合中國藥典藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[16]。

表5 三臺(tái)質(zhì)譜儀殘留結(jié)果

表6 三臺(tái)質(zhì)譜儀基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（%）

2.5 穩(wěn)定性結(jié)果 低、中、高濃度質(zhì)控品分別進(jìn)行室溫放置24h，4℃冰箱放置24h 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（n=5），在TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAP 和API 3200 MD 三臺(tái)質(zhì)譜儀上重復(fù)測(cè)定的偏倚(CV)均小于15%，穩(wěn)定性數(shù)據(jù)符合要求；但根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，樣本4℃冰箱放置其結(jié)果偏倚更小，更穩(wěn)定，在實(shí)際操作中更可行。

表7 三臺(tái)質(zhì)譜儀穩(wěn)定性結(jié)果（n=5）

2.6 臨床應(yīng)用 隨機(jī)收集2019年11月24日～25日的環(huán)孢素樣本100 份，并分別在三臺(tái)質(zhì)譜儀上進(jìn)行檢測(cè)，其中CsA 血藥濃度結(jié)果小于100 的占比58%，結(jié)果大于100 并小于300 的占比42%。其方差分析結(jié)果為F=0.409，P=0.665＞0.05，說明TRIPLE QUADTM4500 MD 與4000 Q TRAP，API 3200 MD 三種方法檢測(cè)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，TRIPLE QUADTM4500 MD 與4000 Q TRAP相關(guān)系數(shù)為0.994 0，4000 Q TRAP 與API 3200 MD樣本結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.996 9，TRIPLE QUADTM4500 MD 與API 3200 MD 相關(guān)系數(shù)為0.995 9,說明三臺(tái)質(zhì)譜儀檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較好，無需換算可直接進(jìn)行互相轉(zhuǎn)換，供臨床參考。見圖2。

圖2 相關(guān)性分析

3 討論

CsA 作為環(huán)狀多肽類免疫抑制劑，主要用于臨床GVHD 的預(yù)防和治療。由于其分子量較大，代謝產(chǎn)物種類較多，且代謝產(chǎn)物含量各異[1-11]。因此，其血藥濃度受不同檢測(cè)方法影響較大[2-5,7-10]。用免疫法檢測(cè)，其代謝產(chǎn)物和結(jié)構(gòu)類似物容易與CsA 發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，導(dǎo)致CsA 血藥濃度檢測(cè)結(jié)果偏高或偏低；同時(shí)又由于CsA 代謝產(chǎn)物活性不同，導(dǎo)致CsA 血藥濃度結(jié)果與臨床現(xiàn)象不符，對(duì)CsA 血藥濃度監(jiān)測(cè)，方法的選擇就顯得尤為重要。DAVID W.Holt等[11]人認(rèn)為色譜法作為CsA 血藥濃度測(cè)定的金標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)譜檢測(cè)具有更高的靈敏度和選擇性。2002年澳大利亞的專家共識(shí)指出CsA 血藥濃度測(cè)定可以選擇免疫法（EMIT，ACMIA）或者是色譜法和質(zhì)譜法，同時(shí)指出隨著質(zhì)譜儀的普及，質(zhì)譜法檢測(cè)CsA血藥濃度將成為趨勢(shì)[12]。2009年WHO 指出CsA血藥濃度測(cè)定應(yīng)選擇特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，避免代謝產(chǎn)物的干擾[13]。同時(shí)西雅圖標(biāo)準(zhǔn)中也指出CsA血藥濃度選擇高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定且梅奧診所也采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜來測(cè)定免疫抑制劑的血藥濃度[14]。2019年，中國治療藥物監(jiān)測(cè)專家共識(shí)指出，從藥物專屬性上推薦采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)用于藥物血藥濃度測(cè)定[15]。本文選擇質(zhì)譜法檢測(cè)CsA 血藥濃度，是基于色譜法作為CsA 血藥濃度監(jiān)測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)而進(jìn)行的，通過確定的質(zhì)量數(shù)特異性監(jiān)測(cè)CsA，進(jìn)而定量，其不受代謝產(chǎn)物和結(jié)構(gòu)類似物的干擾，用于檢測(cè)CsA 母體藥物。

由于本實(shí)驗(yàn)擁有三臺(tái)質(zhì)譜儀（TRIPLE QUADTM4500 MD，4000 Q TRAPAPI 與3200 MD），不同儀器間用于檢測(cè)骨髓移植患者CsA 血藥濃度是否存在差異以及哪臺(tái)儀器更適合的問題，一直困擾實(shí)驗(yàn)室。本試驗(yàn)主要對(duì)以上三種不同型號(hào)質(zhì)譜儀進(jìn)行CsA 血藥濃度進(jìn)行性能驗(yàn)證，以明確哪一種型號(hào)質(zhì)譜儀更加適合CsA 血藥濃度監(jiān)測(cè)，主要通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，日內(nèi)、日間精密度，殘留，基質(zhì)效應(yīng)，穩(wěn)定性這幾方面進(jìn)行驗(yàn)證[15-20]。有以上結(jié)果可見，API 3200 MD 檢測(cè)時(shí)間長，進(jìn)樣量大，質(zhì)譜儀易受污染。本實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)API 3200 MD 對(duì)色譜梯度洗脫方法要求很嚴(yán)格，其影響檢測(cè)穩(wěn)定性因素較多。而TRIPLE QUADTM 4500 MD 與4000 Q TRAP 檢測(cè)時(shí)間短，進(jìn)樣量小，其方法較穩(wěn)定。但由于其價(jià)格較高，尚不能廣泛使用。而API 3200 MD 和TRIPLE QUADTM4500 MD均獲得CFDA批準(zhǔn)，可以用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。整體結(jié)果表明TRIPLE QUADTM4500 MD 與4000 Q TRAP 和API 3200 MD 相比，更適合于CsA 血藥濃度監(jiān)測(cè)。希望基于本試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)臨床如何選擇質(zhì)譜儀監(jiān)測(cè)CsA 血藥濃度提供參考，以便更好地實(shí)現(xiàn)個(gè)體化、合理化用藥[2-5,9-12]。