張 晨，朱海平，金鳳玲，孫虹佳，姚立瓊

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.感染管理科,蘭州 730000)

金黃色葡萄球菌是臨床出現(xiàn)下呼吸道醫(yī)院感染最常見的病原菌[1]，具有較強(qiáng)毒性，能夠引起皮膚黏膜、肺部、心內(nèi)膜、骨關(guān)節(jié)等部位的感染性疾病，嚴(yán)重時(shí)可以引起膿毒性休克及敗血癥等[2]。萬古霉素自1958年應(yīng)用于臨床治療革蘭陽性球菌感染，1961年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）出現(xiàn)后[3]，萬古霉素更是成為治療MRSA 所致感染的最后一道防線，也是為數(shù)不多的對多重耐藥金黃色葡萄球菌有活性的藥物之一。近年來隨著MRSA 的迅速播散以及臨床治療中萬古霉素的濫用，萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌開始出現(xiàn)，包括耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA）、萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌（VISA）及異質(zhì)性耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（h-VISA）[4]。1996年1月日本從一位MRSA 肺炎患者的痰液標(biāo)本中分離出了首例h-VISA。同年，日本報(bào)道分離出第一株VISA[5]，而2002年美國更是出現(xiàn)了首例VRSA[6-7]，這引起了科學(xué)家的極大重視。2006年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)將萬古霉素對金黃色葡萄球菌的折點(diǎn)更新為MIC ≤2 μg/ml 為敏感，4～8μg/ml 為中介，≥16μg/ml 為耐藥。

本試驗(yàn)將前期基礎(chǔ)試驗(yàn)中獲得的一株VISA 和一株h-VISA 通過K-B 法、瓊脂稀釋法、菌譜分析法等進(jìn)行復(fù)核，并對檢出的兩株耐藥菌株進(jìn)行透射電鏡觀察以了解其超微結(jié)構(gòu)及耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 試驗(yàn)菌株為課題前期試驗(yàn)中分離出的兩株萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌，M1278 經(jīng)鑒定為VISA，M1275 為h-VISA。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923 購自甘肅省臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑 法國Bio-Merieux 公司生產(chǎn)的VITEK32 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及配套鑒定試卡、美國Thermo Fisher 公司的二氧化碳培養(yǎng)箱等。鹽酸萬古霉素生產(chǎn)企業(yè)為Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories，有效期內(nèi)使用，使用前用ATCC25923進(jìn)行質(zhì)控；萬古霉素(30μg) 藥敏紙片由英國OXOID 公司生產(chǎn)。腦心浸液肉湯（BHI）產(chǎn)于法國Bio-Merieux 公司；瓊脂粉為英國OXOID 公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 VISA 和h-VISA 的確認(rèn)

1.3.1.1 K-B 法： 按照CLSI 推薦的K-B 法進(jìn)行藥敏試驗(yàn), 采用MH 培養(yǎng)基，30μg 萬古霉素藥敏紙片，37℃ 孵育18 ～24h ,測量抑菌環(huán)直徑。

1.3.1.2 瓊脂稀釋法：在MIC ≥4μg/ml 的BHI-萬古霉素選擇性培養(yǎng)基上如出現(xiàn)1 個(gè)以上菌落生長，經(jīng)質(zhì)譜鑒定確定為金黃色葡萄球菌菌株，可初步認(rèn)定為可疑h-VISA。

1.3.1.3 可疑菌落菌譜分析法[8]：試驗(yàn)菌株M1278和M1275 在血平板上純培養(yǎng)24h, 取M1278 和M1275 的純培養(yǎng)菌落及標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923 用無菌生理鹽水配制成1010CFU/ml，再連續(xù)進(jìn)行10 倍稀釋，配制成102～1010CFU/ml 的菌懸液。在含萬古霉素4～64μg/ml 的萬古霉素選擇性培養(yǎng)基上點(diǎn)種每個(gè)濃度的菌液10μl，37 ℃ 孵育, 分別于24h 和48h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算其相應(yīng)的變異頻率。變異頻率=每塊平板上生長的菌落數(shù)(CFU)/該平板所接種的細(xì)菌總量(CFU)。

1.3.2 耐藥穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取萬古霉素選擇性培養(yǎng)基上分離到的菌株,經(jīng)鑒定為VISA 或h-VISA 后以常規(guī)方法接種于不含任何抗生素的MH 瓊脂平板,持續(xù)傳代9 代以上,再采用瓊脂稀釋法及E-test 法檢測該菌株的MIC。

1.3.3 質(zhì)量控制：為防止假陽性的出現(xiàn)，每次試驗(yàn)應(yīng)使用金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923 作為對照，嚴(yán)格無菌操作，并用比濁儀準(zhǔn)確控制菌懸液的濁度。

1.3.4 透射電鏡標(biāo)本制備過程：挑取血瓊脂平板金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株純培養(yǎng)菌落作為正常對照組。菌落分別用2.5ml/dl 戊二醛固定,PBS 漂洗3次（每次10min），再經(jīng)餓酸固定，系列濃度丙酮+乙醇梯度脫水（每個(gè)濃度脫水10min ），環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、鉛鈾電子染色，透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 K-B 法藥敏試驗(yàn)結(jié)果 K-B 法藥敏試驗(yàn)M1275和M1278 抑菌環(huán)直徑均為6。

2.2 VISA 和h-VISA 檢測結(jié)果

2.2.1 瓊脂稀釋法結(jié)果： 兩株菌（M1275 和M1278）在含4μg/ml 的萬古霉素選擇性培養(yǎng)基上能夠生長。

2.2.2 E-test 法復(fù)查MIC：用E-test 法對MIC 進(jìn)行復(fù)查，M1275 和M1278 的MIC 均為4μg/ml。

2.2.3 萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌菌株菌譜分析：2 株菌均在萬古霉素選擇性培養(yǎng)基上有生長現(xiàn)象，結(jié)果見表1。

表1 2 株萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌菌株菌譜分析結(jié)果

根據(jù)HIRAMATSU的研究[5]，h-VISA 的 判斷標(biāo)準(zhǔn)為：①金黃色葡萄球菌原代菌的MIC 在1～4μg/ml,而子代亞克隆在≥8μg/ml 的萬古霉素選擇性培養(yǎng)基上生長，且變異率≥10-6。②或是在含4μg/ml BHI-萬古霉素選擇性培養(yǎng)基上接種10μl 1010CFU/ml 菌懸液，孵育48 h，出現(xiàn)1 ～30個(gè)菌落則可能為h-VISA。③該亞克隆在不含萬古霉素的培養(yǎng)基上連續(xù)傳9 代耐藥性不丟失[9-10]。通常h-VISA 的判斷標(biāo)準(zhǔn)為①③，但是由于操作繁瑣，工作量大，較難在臨床實(shí)驗(yàn)室開展，因此HIRAMATSU 等[5]重新設(shè)計(jì)了h-VISA 的篩選方法，即②③。

由于本試驗(yàn)采用的是改良前的實(shí)驗(yàn)方去，所以要根據(jù)h-VISA 的判斷標(biāo)準(zhǔn)①③來判定篩出菌株是否是h-VISA，兩株菌M1275 和M1278 的原代MIC 都為4μg/ml，其子代也在≥8μg/ml 的萬古霉素選擇性培養(yǎng)基上能夠生長，但是M1278的變異率只有10-8，達(dá)不到10-6，所以，M1278為萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（VISA），并可認(rèn)為只有M1275 符合判斷標(biāo)準(zhǔn)①③，判定為h-VISA。

2.3 電鏡結(jié)果 見圖1。

圖1 電鏡結(jié)果

3 討論

萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(VISA)可分為同質(zhì)性和異質(zhì)性VISA。同質(zhì)性VISA 是指對萬古霉素MIC 在4 ～8μg/ml 的金黃色葡萄球菌，表現(xiàn)為所有細(xì)菌為單一萬古霉素中介的群體，在無萬古霉素的非選擇性培養(yǎng)基上能夠穩(wěn)定傳代二十代以上。異質(zhì)性VISA（h-VISA）是指金黃色葡萄球菌含有耐萬古霉素的子代，原代菌株對萬古霉素MIC僅為1～2μg/ml，而對萬古霉素 MIC ≥4μg/ml 的子代變異株可通過含4～6μg/ml 萬古霉素的心腦浸液(BHI)選擇瓊脂篩選出來，其出現(xiàn)的頻率是10-6或更高,該子代細(xì)胞亞群在無藥培養(yǎng)基上連續(xù)傳代9代以上仍能保持其耐藥性不變。VISA 和h-VISA 統(tǒng)稱為萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌。在前期實(shí)驗(yàn)過程中篩選出的2 株菌（M1275 和M1278）MIC 為4μg/ml,均為上述萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌。

萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌在電鏡下的形態(tài)改變主要為細(xì)菌細(xì)胞壁增厚、表面凸起增多(見圖1)。金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)主要是肽聚糖，由氨基糖N-乙酰葡糖胺和 N-乙酰胞壁酸交替組成，在電子顯微鏡下觀察細(xì)胞壁平均厚度約為20 ～40nm[11]。金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥機(jī)制目前尚不明確，但有研究認(rèn)為可能與金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁增厚密切相關(guān)。1997年，平松啓一教授研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了萬古霉素敏感度減低的金黃色葡萄球菌VISA 菌Mu50 ( MICvan=8) 和 hVISA 菌Mu3( MICvan=3)[5,12]，并應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Mu50 細(xì)胞壁存在明顯增厚的現(xiàn)象，達(dá)到對照菌株的2 倍[12]。本實(shí)驗(yàn)中M1278（VISA）的細(xì)胞壁厚度為(56.3±12.5)nm，較標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923的細(xì)胞壁厚度(12.5±12.5)nm 明顯增厚，且達(dá)2 倍以上。M1275（h-VISA）的細(xì)胞壁厚度為(31.3±18.8)nm，也較標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923 的細(xì)胞壁明顯增厚。

為進(jìn)一步明確細(xì)胞壁增厚與金黃色葡萄菌對萬古霉素低度耐藥的相關(guān)性，隨后有崔龍洙等[13]研究者收集到7 個(gè)國家的16 株VISA ，研究發(fā)現(xiàn)這16 株VISA 均出現(xiàn)了細(xì)胞壁增厚，且增厚程度與糖肽類抗生素的MIC 值密切相關(guān)，其相關(guān)系 數(shù)為0.908，與替考拉寧的相關(guān)系數(shù)為0.655。國內(nèi)也有研究得出相類似的結(jié)論[14]。關(guān)于細(xì)胞壁增厚與金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥的關(guān)系目前認(rèn)為可能有兩種機(jī)制[15]：一種為“親和誘捕”，普遍認(rèn)為在增厚的細(xì)胞壁肽聚糖層上有大量D-丙氨酰-D-丙氨酸殘基存在，這些殘基與萬古霉素有著較強(qiáng)的親和力，可與大量萬古霉素結(jié)合，導(dǎo)致大部分的萬古霉素藥物分子結(jié)合在細(xì)胞壁外層肽聚糖的殘基上，而不能到達(dá)肽聚糖合成的活性部位，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥；第二種是“阻塞現(xiàn)象”，萬古霉素分子與金黃色葡萄球菌表面肽聚糖層上的D-丙氨酰-D-丙氨酸殘基的結(jié)合，結(jié)合體阻塞了肽聚糖層的網(wǎng)孔，阻止了其它萬古霉素分子繼續(xù)向細(xì)胞內(nèi)滲透到達(dá)靶位，繼而導(dǎo)致金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥。

本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)透射電鏡顯示，M1275(h-VRSA)和M1278（VISA)與金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923 相比細(xì)胞壁明顯增厚，證明h-VRSA和VISA 對萬古霉素耐藥很可能是由于細(xì)菌細(xì)胞壁增厚所引起的。但仍需進(jìn)一步進(jìn)行PCR 試驗(yàn)對兩株菌進(jìn)行萬古霉素耐藥基因的檢測，以排除耐藥是因獲得萬古霉素耐藥基因所引起的可能性。前期實(shí)驗(yàn)中獲得的VISA 和h-VISA 較少，可進(jìn)一步對M1275(h-VISA)進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察隨著萬古霉素誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的增加，h-VRSA 誘導(dǎo)株的MIC 和細(xì)胞壁厚度是否相應(yīng)的增加，以驗(yàn)證本次電鏡結(jié)果。