王超男，李偉皓，沈?qū)毱G，李江雪，張 佳，劉曉梅，張菲菲，張智萍，馮曉燕，張賀秋

（1.東方海洋（北京）醫(yī)學(xué)研究院，北京 100071； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院特檢科，石家莊 050000；3.蒙城縣第一人民醫(yī)院腎病免疫風(fēng)濕科，安徽亳州233500）

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是一種器官特異性自身免疫疾病，是導(dǎo)致成人腎病綜合征的常見病因[1-3]。根據(jù)病因?qū)⒛ば阅I病分為兩類，第一類為沒有明確病因的“原發(fā)性膜性腎病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）”，約占總患病人數(shù)的70%。第二類為由乙型肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、癌癥和藥物不良反應(yīng)等引起的“繼發(fā)性膜性腎病（secondary membranous nephropathy，SMN）”，約占總患病人數(shù)的30%[4]。IMN 和SMN 的臨床表現(xiàn)和組織學(xué)表現(xiàn)相同，但治療方法完全不同[5-6]，IMN 的治療更為復(fù)雜，包括多種治療方案，所以針對IMN 的正確鑒別診斷尤為重要。

目前臨床上IMN 的診斷主要包括兩類方法，一類是侵入性診斷方法，如腎臟穿刺、組織學(xué)檢查或腎組織電鏡檢查等，但侵入性方法為有創(chuàng)性操作，會對患者造成一定程度上的傷害，風(fēng)險高，可能會引起一系列并發(fā)癥，并且不適于動態(tài)觀察患者病情。2009年，BECK 等[7-8]首次發(fā)現(xiàn)了膜性腎病的靶抗原-M 型磷脂酶A2 受體（phospholipase A2 receptor,PLA2R），表明PLA2R 是IMN 的一個主要自身抗原。隨之出現(xiàn)了另一類非侵入性的PLA2R 自身抗體血清學(xué)診斷方法[9-10]，不僅快速、簡便易行，而且可以動態(tài)觀察病情，指導(dǎo)治療[11]，主要包括細胞免疫熒光方法（immunofluorescence assay，IFA）和酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）。但ELISA 方法由于存在與抗人IgG 的非特異反應(yīng)，易出現(xiàn)假陽性。而IFA 方法不但具有血清學(xué)檢測的優(yōu)勢，還能夠直觀觀察熒光的細胞分布，提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性，被譽為自身抗體血清學(xué)檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

但是目前對于PLA2R 自身抗體的檢測只有德國歐蒙公司的進口試劑，且價格昂貴。因此，本研究目的在于構(gòu)建表達PLA2R 蛋白的穩(wěn)定細胞株，并對其在膜性腎病診斷中的應(yīng)用進行探索，以期能夠為實現(xiàn)PLA2R 自身抗體檢測試劑的國產(chǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和蒙城縣第一人民醫(yī)院2018 ～2019年就診并進行抗PLA2R 抗體檢測的腎病患者血清共97 例，患者年齡16 ～74 歲，平均年齡48.2±15.9 歲，男性61 例，女性36 例。根據(jù)歐蒙抗PLA2R 抗體IgG 檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法），當(dāng)血清抗PLA2R 抗體＜14 RU/ml 時，則認為血清呈抗PLA2R 抗體陰性，當(dāng)血清抗PLA2R 抗體≥14 RU/ml 時，則認為血清呈抗PLA2R 抗體陽性。陰性組55 例，男性32 例，女性23 例，平均年齡48±16.2 歲；陽性組42 例，男性27 例，女性15 例，平均年齡48±15.9 歲。血清無脂血、溶血等不合格情況，收集于干燥潔凈EP 管，?80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 pIRES-PLA2R 質(zhì)粒（北京中美泰和公司）；質(zhì)粒抽提純化試劑盒（QIAGEN 公司）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Thermofisher公司）；CHO（中國倉鼠卵巢腦細胞，Chinese Hamsters Ovary）細胞（ATCC）；抗生素G-418（Sigma公司）；通用總蛋白質(zhì)提取試劑盒（上海生工公司）；總RNA 提取試劑盒（上海生工公司）；RTPCR 試劑盒SuperScript ? One-Step RT-PCR System（Thermofisher 公司）；兔抗PLA2R 多抗（Atlas公司） ；FITC-羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋公司）；FITC-羊抗人IgG 抗體（北京中杉金橋公司）。

1.3 方法

1.3.1 PLA2R 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建：綜合生物信息學(xué)分析和文獻報道，從NCBI 數(shù)據(jù)庫調(diào)取PLA2R的全長編碼基因（NM_007366.4）。由于PLA2R全長編碼基因的長度較長，為避免在基因調(diào)取和擴增過程中產(chǎn)生基因突變，委托北京中美泰和公司進行基因合成并將全長基因連接到真核表達質(zhì)粒pIRESneo 中，構(gòu)建pIRES-PLA2R 質(zhì)粒。用質(zhì)粒純化試劑盒抽提pIRES-PLA2R 質(zhì)粒并瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.2 PLA2R 穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建：pIRESPLA2R 質(zhì)粒定量后用于真核細胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前一天將CHO 細胞以3×105個/ 孔的密度接種于6 孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜。按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別用PLA2R 真核表達質(zhì)粒pIRES-PLA2R、空質(zhì)粒pIRESneo 和不含質(zhì)粒的PBS 轉(zhuǎn)染CHO 細胞。轉(zhuǎn)染48 h 后更換為含1mg/ml G-418 的完全培養(yǎng)液，每隔3 天更換新鮮培養(yǎng)液。

1.3.3 PLA2R 穩(wěn)定表達細胞株的鑒定：待CHOPLA2R 組、CHO-Control 組正常生長且PBS 對照組細胞全部死亡時，收取CHO-PLA2R 組和CHOControl 組的部分細胞進行RT-RCR，Western 免疫印跡和IFA 鑒定。

1.3.3.1 RT-RCR 鑒 定：用 總RNA提取試劑盒提取CHO-PLA2R 組 和CHO-Control 組細胞的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄PCR 鑒定。根據(jù)PLA2R 全長基因，設(shè)計合成RT-PCR 鑒定引物F1（序列：TCGTTTCCTTACGGTGGCCGCT）和R1（序列：TTCTGCAGAGGTGGGATCAG）。 根 據(jù)RT-PCR試劑盒說明書，取4μl RNA 提取物作為擴增模板，F(xiàn)1/R1 作為引物對，按試劑盒要求進行一步法RTPCR，50℃ 30 min 逆轉(zhuǎn)錄，95℃ 15 min 預(yù)變性后，進行PCR 循環(huán)：95℃ 45 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，循環(huán)40 次，72℃延伸5 min。取PCR 產(chǎn)物5 μl 進行1g/dl 瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.3.2 Western 免疫印跡鑒定：用細胞總蛋白提取試劑盒提取CHO-PLA2R 組和CHO-Control 組的細胞總蛋白，進行Western 免疫印跡鑒定。取總蛋白80μg 進行8g/dl SDS-PAGE，然后電轉(zhuǎn)印于PVDF膜。封閉后加入1:1 000 稀釋的抗PLA2R 抗體，4℃孵育過夜。洗膜后加入1:500 稀釋的FITC-羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。洗膜后ECL 顯色。

1.3.3.3 細胞免疫熒光鑒定：在IFA 方法鑒定前一天將經(jīng)G-418 篩選的CHO-PLA2R 細胞和CHOControl 細胞以1×105個/孔的密度接種于96 孔板中，37℃培養(yǎng)過夜，PBS 洗1 次，每次5 min。用4ml/dl 多聚甲醛固定，PBS 洗3 次。PBS 洗后加入1∶100 稀釋的FITC-兔抗PLA2R 抗體，濕盒室溫孵育2h，PBS 洗3 次。加入1∶400 稀釋的FITC-羊抗兔IgG，濕盒室溫孵育30min，PBS 洗3 次。防熒光淬滅劑封片，置熒光顯微鏡下觀察，同時設(shè)未轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。

1.3.4 PLA2R 穩(wěn)定表達細胞株的細胞免疫熒光方法的初步評價：用CHO-PLA2R 細胞作為基質(zhì)對97例腎病患者血清樣本進行檢測。在IFA 方法檢測前一天將CHO-PLA2R 細胞以1×105個/孔的密度接種于96 孔板中，37℃培養(yǎng)過夜，PBS 洗1 次，每次5min。4ml/dl 多聚甲醛固定15 min。PBS 洗后加入1∶50 稀釋的血清樣本，濕盒室溫孵育2 h。PBS洗后加入1∶300 稀釋的FITC-羊抗人IgG，濕盒室溫孵育30 min。PBS 洗后加入防熒光淬滅劑封片，置熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用Kappa 檢驗對兩種方法的評價結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。對P 值和Kappa 值進行分析。如果P＜0.05，則具有一定的一致性。Kappa值＜0.2 則說明一致性程度較差；0.2～0.4 則說明一致性程度一般；0.4～0.6 則說明一致性程度中等；0.6～0.8 則說明一致性程度較強；0.8～1.0 則說明一致性程度很強。

2 結(jié)果

2.1 PLA2R 真核表達質(zhì)粒的鑒定 北京中美泰和公司完成基因合成和pIRES-PLA2R 質(zhì)粒構(gòu)建，并提供測序報告證明PLA2R 基因序列完全正確。

抽提pIRES-PLA2R 質(zhì)粒。根據(jù)pIRESneo 質(zhì)粒說明書，pIRESneo 質(zhì)粒分子量大小應(yīng)為5.3kb，合成的全長編碼基因大小為4 389bp，因此pIRESPLA2R 質(zhì)粒的分子量大小約為9.8kb。瓊脂糖凝膠電泳顯示pIRES-PLA2R 質(zhì)粒分子量大小與預(yù)期分子量大小一致，見圖1。成功抽提供細胞轉(zhuǎn)染的PLA2R 真核表達質(zhì)粒pIRES-PLA2R，質(zhì)粒濃度為0.48 μg/μl。

2.2 PLA2R 穩(wěn)定表達細胞株CHO-PLA2R 的鑒定分別以PLA2R 真核表達質(zhì)粒pIRES-PLA2R 和空質(zhì)粒pIRESneo 轉(zhuǎn)染CHO 細胞，經(jīng)G-418 篩選后獲得表達PLA2R 的穩(wěn)定細胞株CHO-PLA2R 和對照細胞株CHO-Control，鑒定結(jié)果見圖1。

2.2.1 RT-PCR鑒定提取CHO-PLA2R 組 和CHOControl 組細胞的總RNA：以鑒定引物F1/R1 進行一步法RT-PCR。結(jié)果顯示CHO-PLA2R 組在350bp處出現(xiàn)一條唯一條帶，而CHO-Control 組細胞未見擴增條帶，見圖2。與預(yù)期結(jié)果相符，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株CHO-PLA2R 能夠正常轉(zhuǎn)錄PLA2R 基因。

圖2 細胞總RNA RT-PCR 鑒定

2.2.2 Western 免疫印跡鑒定提取CHO-PLA2R 組和CHO-Control 組細胞的總蛋白：以PLA2R 兔多抗為一抗進行Western 免疫印跡實驗。結(jié)果顯示CHO-PLA2R 組在約180kD 處有明顯條帶，與PLA2R 蛋白的預(yù)期分子量相符，而CHO-Control組未見相應(yīng)條帶，見圖3。表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株CHO-PLA2R 可以穩(wěn)定表達PLA2R 蛋白。

圖3 細胞總蛋白Western 免疫印跡鑒定

2.2.3 細胞免疫熒光鑒定：以抗PLA2R 抗體為一抗進行IFA 實驗，結(jié)果顯示，CHO-PLA2R 細胞在細胞質(zhì)部分呈現(xiàn)較強的綠色熒光，而CHO-Control細胞則幾乎無熒光（見圖4）。表明成功構(gòu)建穩(wěn)定細胞株CHO-PLA2R，可以高水平表達PLA2R 蛋白。

圖4 CHO-PLA2R 細胞IFA 方法鑒定

2.3 PLA2R 穩(wěn)定表達細胞株CHO-PLA2R 的初步應(yīng)用 用篩選出的CHO-PLA2R 細胞對97 例臨床腎病患者樣本進行檢測，檢測結(jié)果見表1。PLA2R自身抗體的ELISA 檢測結(jié)果為陰性55 例，陽性42例。55 例ELISA 檢測陰性（＜14 RU/ml）樣本中，CHO-PLA2R 細胞IFA 方法檢測結(jié)果均為陰性見圖5，特異性符合率100%（55/55）。ELISA 檢測陽性（≥14 RU/ml）樣本共42 例，其中陽性高值（≥100 RU/ml））樣本26 例，陽性低值（14 ～99 RU/ml）樣本16 例。ELISA 檢測陽性樣本中，IFA方法檢測結(jié)果陽性32 例（見圖5），陰性10 例，符合率76.2%（32/42）。其中，ELISA 檢測陽性高值26 例樣本中，IFA 方法檢測結(jié)果陽性24 例，陰性2 例，符合率92.3%（24/26）；ELISA 檢測陽性低值16 例樣本中，IFA 方法檢測結(jié)果陽性8 例，陰性8 例，符合率50%（8/16）。97 例腎病患者血清樣本兩種檢測方法的總符合率為89.7%（87/97）。

表1 97 例腎病患者血清樣本抗PLA2R 抗體ELISA 方法與IFA 方法結(jié)果對比

圖5 血清樣本IFA 實驗結(jié)果

使用Kappa 檢驗對兩種方法評價結(jié)果的一致性進行統(tǒng)計學(xué)分析，ELISA 結(jié)果陽性樣本和ELISA 結(jié)果陰性樣本均具有一定的一致性（均P＜0.05），其中ELISA 結(jié)果陽性樣本一致性程度中等（Kappa=0.456），ELISA 結(jié)果陰性樣本一致性很強（Kappa=1.0）。

3 討論

慢性腎病被稱為“沉默的殺手”，很多患者早期沒有癥狀，其中約30%～50%的患者將發(fā)展為終末期腎病，對患者的身心健康造成極大影響[1-2]。我國的MN 發(fā)病幾率逐年上升，從2005年到2017年，MN 在我國的腎活檢病人中發(fā)病率由9.1%增長到26.5%[9]。MN 可根據(jù)病因分為原發(fā)性膜性腎病和繼發(fā)性膜性腎病，其中IMN 的發(fā)病率在我國已達到70%～80%[4]。IMN 和SMN 的臨床表現(xiàn)十分相近，但治療方法卻完全不同，因此正確鑒別IMN在臨床診斷和治療工作中具有十分重要的意義。目前，MN 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是腎穿刺活檢術(shù)，但其為有創(chuàng)性操作，不便于病情的動態(tài)觀察，也不能鑒別IMN 與SMN。

PLA2R 是I 型跨膜蛋白，屬于C 型外源性凝集素家族[12-13]。2009年，BECK 研究團隊在70%的IMN 患者體內(nèi)檢出PLA2R，提示PLA2R 可能參與了IMN 發(fā)病過程。隨后，HOXHA 等[14]人發(fā)現(xiàn)IMN 患者體內(nèi)抗PLA2R 抗體的陽性率高達81%。日本一項研究結(jié)果顯示，IMN 患者體內(nèi)抗PLA2R抗體的陽性率為53%[15]。近期國內(nèi)的一項研究結(jié)果顯示，IMN 患者體內(nèi)抗PLA2R 抗體的陽性率為57%[16]，另一項研究中陽性率高達85.4%[17]。以上研究提示抗PLA2R 自身抗體可能是導(dǎo)致IMN 的致病抗體。多個研究表明，抗PLA2R 抗體診斷IMN 的靈敏度可達70%～85%，特異度更是高達99%[18-20]。因此，抗PLA2R 抗體作為一種病原標(biāo)志物極具診斷意義。此外，針對PLA2R 自身抗體開發(fā)的血清學(xué)檢測不僅快速、簡便易行，還可以動態(tài)監(jiān)測病情活動，為IMN 的治療和預(yù)后提供參考。因此，本文構(gòu)建了表達PLA2R 的穩(wěn)定細胞株，以期提供一種高效的IMN 體外診斷工具。

本文首先構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pIRES-PLA2R。用pIRES-PLA2R 質(zhì)粒對CHO 細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，RT-PCR 實驗、Western 免疫印跡實驗和IFA 實驗分別從分子、蛋白和細胞水平證明成功構(gòu)建表達PLA2R 蛋白的穩(wěn)定細胞株CHO-PLA2R。

將所構(gòu)建的細胞株應(yīng)用于抗PLA2R 抗體的IFA 方法體外診斷，與ELISA 方法相比，陰性樣本的符合率為100%（55/55）；陽性樣本的總符合率為76.2%（32/42），其中陽性高值樣本的符合率為92.3%（24/26），陽性低值樣本的符合率為50%（8/16）；樣本的總體符合率為89.7%（87/97）。使用Kappa 檢驗分析兩種方法的一致性，ELISA 陽性樣本和ELISA 陰性樣本均具有一定的一致性，其中ELISA 陽性樣本的一致性程度中等，也就是對陽性樣本檢測的符合率較低；ELISA 陰性樣本結(jié)果一致性強，也就是對陰性樣本檢測的符合率高。ELISA 陽性樣本結(jié)果一致性不強主要是由于弱陽性樣本的符合率不高（50%，8/16）。

部分ELISA 檢測陽性樣本在本實驗中使用IFA方法未能成功檢出，分析原因可能是作為對照的ELISA 方法由于酶聯(lián)板的非特異吸附、二抗的非特異性結(jié)合、血清中的其他自身抗體引起的非特異反應(yīng)大大增加了假陽性率，使得ELISA 方法弱陽性結(jié)果的準(zhǔn)確性降低。而IFA 方法是檢測自身抗體的經(jīng)典方法。理論上，只要胞膜或胞漿中存在相應(yīng)的抗原，就可特異性檢測對應(yīng)抗體，因此，根據(jù)是否存在熒光可以檢測是否存在相應(yīng)的自身抗體（圖5A，5B）。另一方面，根據(jù)熒光的分布特點及其與對照細胞的熒光比較可以排除非特異熒光結(jié)果，從而能夠減少假陽性，提高準(zhǔn)確性，減少誤診。例如在本文的方法中，有些樣本檢測時整個細胞均呈現(xiàn)熒光，或者在細胞核而非細胞質(zhì)呈現(xiàn)強熒光，還有些樣本的熒光分布與CHO-Control 對照細胞完全相同，即可判定為非特異性反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，基于CHO-PLA2R 細胞株建立的IFA 檢測方法具有很高的特異性，為IMN 的深入研究及體外診斷提供了有力的生物學(xué)工具。但是，該方法對ELISA檢測灰區(qū)附近的弱陽性樣本無法明確判斷，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。我們將對IFA 方法進一步改進，以提高靈敏度。另外，與ELISA 方法相比，IFA 方法無法進行精確定量檢測，不能用于IMN 患者的療效評估，在臨床上需要與ELISA 方法聯(lián)合使用。