魏華民 章從恩 李楊帆

摘要 目的：初步分析大鼠口服雙參顆粒散劑與水煎劑后的入血成分差異。方法：采用LC/MS-IT-TOF方法對(duì)雙參顆粒醇提取物、水提取物含藥血清、散劑含藥血清進(jìn)行分析，根據(jù)保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量，質(zhì)譜數(shù)據(jù)等完成各組成分差異比較。結(jié)果：和水煎劑比較，初步鑒定出雙參顆粒散劑特有的4個(gè)原型吸收入血成分，分別是Ginsenoside-Rh1，Ginsenoside-Rg2，Ginsenoside-Rb2和Ginsenoside-Rg3。結(jié)論：雙參顆粒散劑和水煎劑在大鼠入血成分存在差異，這些入血成分可能是雙參顆粒散劑異于水煎劑在血中起直接作用的物質(zhì)。

關(guān)鍵詞 雙參顆粒;入血成分;散劑;水煎劑;LC/MS-IT-TOF

Abstract Objective：To preliminary analyze the plasma effective components Difference of rats after intragastric administration of Shuangshen Granules（SSG）.Methods：The liquid-mass spectrometer-ion trap-time-of-flight mass spectrometry （LC/MS-IT-TOF） method was used to analyze the medicated serum of Shuangshen Granules pulvis and water decoction，according to the retention time，accurate relative molecular mass，mass spectrometry data，etc.the components differences between groups were compared.Results：Compared with water decoction，there are 4 plasma effective components of Shuangshen Granules Pulvis：Ginsenoside-Rh1，Ginsenoside-Rg2，Ginsenoside-Rb2 and Ginsenoside-Rg3.Conclusion：Different plasma effective components were found between pulvis and water decoction of SSG after intragastric administration by rats，different from water decoction，these plasma effective components may be substances in which pulvis plays a direct role in blood.

Keywords Shuangshen Granules; Plasma effective components; Pulvis; Water decoction; LC/MS-IT-TOF

中圖分類(lèi)號(hào)：R284;R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.001

雙參顆粒是中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院花寶金教授的發(fā)明專(zhuān)利（國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利：201310091864.4），由西洋參、三七及冬蟲(chóng)夏草組成，以散劑口服為主，主要用于防治肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]，我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙參顆粒對(duì)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成有較強(qiáng)的干預(yù)作用，并且發(fā)現(xiàn)散劑明顯優(yōu)于水煎劑[2-3]，所以研究雙參顆粒的入血成分對(duì)分析雙參顆粒干預(yù)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境是重要的補(bǔ)充，而且雙參顆粒的基礎(chǔ)研究仍較為薄弱，特別是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，這些都在一定程度上影響了雙參顆粒的合理開(kāi)發(fā)和使用。所以本研究進(jìn)一步對(duì)本批次雙參顆粒進(jìn)行了質(zhì)譜分析，為闡明其散劑的有效性及進(jìn)一步研究其入血成分以肺及骨髓微環(huán)境的作用提供基礎(chǔ)。

中藥成分復(fù)雜，通過(guò)口服給藥，真正入血的成分才有可能是中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，分析和尋找口服后能夠入血的原型成分及代謝產(chǎn)物，才能夠?yàn)殛U明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供一定的依據(jù)[4-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用LC/MS-IT-TOF技術(shù)初步分析雙參顆粒血中移行成分并與水煎劑比較，以闡明其在體內(nèi)的直接作用物質(zhì)基礎(chǔ)，為雙參顆粒的藥代動(dòng)力學(xué)和質(zhì)量控制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：大鼠11400700375241），大鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)室合格證號(hào)：SYXK（京）2017-0019，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)：18-2031]，分籠飼養(yǎng)，每籠4只，保證大鼠有充足的活動(dòng)空間。自由飲水及進(jìn)食，飼養(yǎng)期間維持室內(nèi)溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度約為（50±2）%，通風(fēng)良好、環(huán)境安靜，模擬自然條件維持每12 h/12 h晝夜燈光交替，飼料為實(shí)驗(yàn)室提供大鼠專(zhuān)用飼料，每周換籠清潔至少2次。

1.1.2 藥物 雙參顆粒藥材（西洋參、冬蟲(chóng)夏草、三七）采購(gòu)自華邈藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)批號(hào)分別為：20180201，20180217，20180119）。雙參顆粒提取物（自制），水為自制超純水，甲醇（Fisher Scientific公司，貨號(hào)：950055）、乙腈為色譜純（Fisher Scientific公司，貨號(hào)：TS-51101），其余試劑均為分析純。

1.1.3 試劑與儀器 高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津Shimadzu，日本，型號(hào)：LC-MS-IT-TOF）;Radient A10 Mill-Q超純水器（Millipore公司，美國(guó)，型號(hào)：Radient A10）;冷凍離心機(jī)（Sigma，德國(guó)，型號(hào)：3-18k）;微量分析天平（Mettler Toledo，瑞士，型號(hào)：AL204）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）梯度洗脫（0～3 min，5% ～8% B;3～6 min，8% ～10% B;7～15 min，10% ～30% B;15～25 min，30% ～60% B;25～30 min，60% ～95% B;30～35 min，95% B;35～40 min，95%B），流速1 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，掃描方式為負(fù)離子掃描（m/z 100～1 000），毛細(xì)管電壓4.5 kV，錐孔電壓150 V，離子源溫度110 ℃，霧化氣（N2）壓力0.12 MPa，霧化氣溫度200 ℃，流速8.0 mL/min。

1.2.3 雙參顆粒提取物制備 通過(guò)本課題組前期藥效學(xué)試驗(yàn)優(yōu)選并確定了雙參顆粒提取物的制備工藝。取雙參顆粒藥材（西洋參、冬蟲(chóng)夏草和三七粉混合物）100 g，加8倍量70%乙醇提取3次，提取時(shí)間分別為1.5 h、1.0 h、1.0 h，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至1 g/mL（以生藥量計(jì)），加1倍量水飽和的正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇液，減壓回收正丁醇，45 ℃真空干燥，即得。

1.2.4 供試品溶液的制備 取雙參顆粒提取物粉末（過(guò)三號(hào)篩，下同）0.1 g，精密稱(chēng)定，加入50%甲醇10 mL，超聲10 min，12 000 r/min，離心半徑10 cm，低溫（4 ℃，下同）離心10 min，取上清液，即得。

1.2.5 血清的制備 取清潔級(jí)SD大鼠，雄性。隨機(jī)分成水煎劑組和顆粒組，每組6只。禁食12 h，但自由飲水。根據(jù)雙參顆粒常用劑量和課題組前期開(kāi)展的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，以及血清藥物化學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇50 g/kg（以生藥量計(jì)）作為給藥劑量灌胃給予雙參顆粒提取物，于給藥后30 min后尾靜脈采血，取全血置于37 ℃水浴保溫至上層有淡黃色液體析出，取出后于離心機(jī)中3 000 r/min，離心半徑10 cm，低溫離心10 min。取上層血清，將同一組各血清混合，以消除個(gè)體差異，置于-20 ℃保存，備用。

1.2.6 血清樣品的處理 取2組含藥血清各600 μL，依次加入10%甲酸水溶液120 μL和甲醇2.4 mL，渦旋混合2 min，超聲5 min，低溫離心（12 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min）。隨后取上清液置氮吹儀中，37 ℃下吹干。殘留物加入50%甲醇150 μL復(fù)溶，渦旋1 min，超聲10 min，低溫離心，取水煎劑含藥血清樣品、顆粒劑血清樣品，供血清藥物化學(xué)研究。

2 結(jié)果

2.1 圖譜的采集 根據(jù)1.2.1與1.2.2項(xiàng)下條件，采用正負(fù)離子模式對(duì)雙參顆粒提取物、水煎劑含藥血清和顆粒劑血清樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以顆粒劑醇提取物為對(duì)照，分析散劑含藥血清及水煎劑含藥血清中藥物成分的差異。見(jiàn)圖1、2。

2.2 雙參顆粒入血成分的分析與鑒定 根據(jù)1.2.1與1.2.2項(xiàng)下條件，比較雙參顆粒醇提取物樣品液、雙參顆粒水煎劑含藥血清和雙參顆粒散劑血清的差異色譜圖發(fā)現(xiàn)，雙參顆粒提取物含藥血清中出現(xiàn)了8個(gè)入血成分。見(jiàn)表1。其中4個(gè)為文獻(xiàn)報(bào)道的原型收入血成分。見(jiàn)表2。典型的Rg2/3質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。主要入血成分質(zhì)譜見(jiàn)圖4。

3 討論

中藥有丸散膏丹等不同傳統(tǒng)劑型，每種劑型都有不同的適應(yīng)證，根據(jù)臨床需要適時(shí)選用，其中散劑和湯劑都是臨床常用的藥劑類(lèi)型，各有特點(diǎn)而在臨床使用方面不能完全相互替代。有研究顯示中藥傳統(tǒng)劑型五苓散要比相同藥物的水煎劑效果更好[7-10]，這說(shuō)明散劑有其特殊的臨床價(jià)值。雙參顆粒作為預(yù)防肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有效方劑，也是作為散劑口服應(yīng)用。我們?cè)谇捌趧?dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，雙參顆粒散劑、水煎劑及醇提劑有著顯著的效用差異[3]，所以本研究通過(guò)建立LC/MS-IT-TOF對(duì)雙參顆粒含藥血清的檢測(cè)方法，主要比對(duì)雙參顆粒散劑和水煎劑的入血成分差異，該方法可合理的將超高效液相色譜強(qiáng)大的分離能力和質(zhì)譜的高分辨特點(diǎn)運(yùn)用在復(fù)方中藥體系中，具有離子傳輸效率高、靈敏度高、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。由于有些生理反應(yīng)是在血液中完成的，所以研究中藥復(fù)方的入血成分對(duì)這些過(guò)程干預(yù)機(jī)制研究有重要意義[13]。有研究發(fā)現(xiàn)在荷瘤小鼠，骨髓細(xì)胞向髓源性抑制細(xì)胞的分化過(guò)程就是在血中完成的，在接近靶器官的時(shí)候血中的骨髓細(xì)胞完成分化，使得髓源性抑制細(xì)胞在靶器官定植并改善局部的免疫抑制微環(huán)境從而導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[14]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，雙參顆粒散劑和水煎劑比較可以顯著降低肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中髓源性抑制細(xì)胞的比例（結(jié)果未發(fā)表），這有可能是某些入血成分干預(yù)了髓系細(xì)胞分化的過(guò)程所致，所以本研究重點(diǎn)分析了不同時(shí)間點(diǎn)散劑和水煎劑入血成分的差異。

我們給大鼠灌胃雙參顆粒水煎劑和顆粒劑后，分別考察30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h血清的質(zhì)譜信息，通過(guò)對(duì)不同樣品的色譜圖峰強(qiáng)度、峰數(shù)目及入血峰面積等結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，還分別采用正、負(fù)離子掃描方式對(duì)雙參顆粒提取物樣品液進(jìn)行全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正負(fù)離子模式下雙參顆粒提取物樣品液中的化合物響應(yīng)均較高，并且各色譜峰之間實(shí)現(xiàn)了較好的分離。本研究通過(guò)對(duì)比雙參顆粒提取物、水煎劑含藥血清、顆粒劑含藥血清指紋圖譜，進(jìn)行水煎劑含藥血清與顆粒劑含藥血清的差異圖譜分析，從血清中檢測(cè)出8個(gè)入血成分，其中4個(gè)為原型成分。根據(jù)質(zhì)譜所提供的保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量的比較，鑒定出了其中的4個(gè)原型吸收入血成分，分別是Ginsenoside-Rh1，Ginsenoside-Rg2，Ginsenoside-Rb2和Ginsenoside-Rg3。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，我們推測(cè)上述4個(gè)原型成分可能是散劑優(yōu)于水煎劑效果的物質(zhì)基礎(chǔ)，是雙參顆粒散劑在體內(nèi)發(fā)揮藥效的有效組分群，既往的研究證實(shí)人參/三七皂苷不僅具有一定的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，而且可以上調(diào)造血細(xì)胞增殖的相關(guān)基因，通過(guò)JAK2/STAT5促進(jìn)人CD34+細(xì)胞向紅系分化[14-18]，增加骨髓中間充值干細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶的水平[19]，且具有一定的促進(jìn)骨髓細(xì)胞分泌諸如GM-CSF的細(xì)胞因子[20-21]的作用，正是由于人參皂苷對(duì)骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)代謝及細(xì)胞分泌因子均具有影響作用，所以我們推測(cè)上述4種成分可能是雙參顆粒散劑抑制血液細(xì)胞成分分化從而干預(yù)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的效用成分。但由于實(shí)驗(yàn)方法有限，可能存在某些極性小的或者不能電離的化合物不能被檢測(cè)到的情況，當(dāng)然也需要后續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)化合物成分，本實(shí)驗(yàn)在一定程度上為雙參顆粒的后續(xù)藥理活性和藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也可為闡明雙參顆粒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供參考，為精準(zhǔn)治療藥物的開(kāi)發(fā)奠定了部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（2019-12-24收稿 責(zé)任編輯：王明）