閆立萍 劉華 王小軍 羅天雯

甘肅省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,蘭州730000通信作者：劉華,Email:13919965016@163.com

分子靶向治療是目前臨床針對晚期非小細胞肺癌尤其是存在基因突變的肺腺癌的最新治療手段。2018年我國最新版肺癌治療指南中將酪氨酸激酶抑制劑 (tyrosine kinase inhibitors,TKI)藥物單用或聯合含鉑藥物化療作為有EGFR 基因突變腺癌患者(Ⅱ、Ⅲ期)的一線治療方案。在眾多TKI藥物中,吉非替尼是上市最早、療效肯定、經典型TKI藥物代表。然而,早期出現耐藥是TKI藥物臨床治療的硬傷。由此,提高TKI藥物敏感性、降低耐藥性是目前聯合用藥,尤其聯合中藥制劑治療的探索方向。紅芪多糖 (hedysarum polysaccharides,HPS)是甘肅省道地藥材,在前期研究中,顯示HPS具有顯著抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化和凋亡的作用[1-3]。HPS由3種單糖組成,其發(fā)揮主要作用的組份為HPS1。本研究旨在探討HPS1 聯合吉非替尼誘導肺癌細胞凋亡,以及調節(jié)Bax和Bcl-2蛋白表達的機制,以期為中藥聯合抗腫瘤研究提供新的思路和數據支持。

1 材料與方法

1.1 細胞株及藥物 人肺腺癌A549細胞株購自武漢大學保藏中心。HPS1由蘭州大學藥學院提取并鑒定,為白色絮狀粉末,蛋白含量為0.2%,相對分子質量為9.4×104,為均一多糖。吉非替尼購自 英 國 阿 斯 利 康 公 司,DMSO 溶 解 至500 mmol/L,置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 DMEM (美國Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),胰酶(美國Difco公司),TRIzol提取試劑盒、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR 試劑盒 (日本Ta KaRa公司),MTT (美國Amresco公司),Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒 (美國Beckman Coulter公司),實時熒光定量PCR 引物[寶生物工程 (大連)有限公司]。

1.3 儀器 CO2孵育箱 (美國Thermo 公司,HERAcell150),ESCO 超凈工作臺 (中國蘇州合飛凈化設備有限公司,sw-cj-2f),光學倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,CKX41+DP21),酶標儀(美國Bio-rad 公司,iMark),流式細胞儀 (美國Becton, Dickinson and Company 公 司,FACSVerse),低溫離心機(德國Eppendorf公司,Centrifuge 5427R)。

1.4 細胞培養(yǎng)方法 A549細胞株用含10%胎牛血清的DMEM 液培養(yǎng),在37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng),隔天觀察細胞貼壁情況并換液。貼壁生長良好的A549細胞經0.25%胰蛋白酶消化,選用對數生長期細胞進行實驗。

1.5 MTT 檢測方法 將細胞懸液移入3塊96孔板,接種細胞密度為1×104個細胞/孔,培養(yǎng)24 h后,各實驗組按終濃度配置并加入96孔板,每個濃度設5 個平行孔。共設3 個時間點 (6、24、48 h),每個時間點取一塊96 孔板,每孔加入MTT 溶液(5 g/L)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸棄所有溶液,加入SDS細胞裂解液100μl,4℃反應過夜,取出后置水平搖床10 min充分溶解。最后用酶標儀于490 nm 波長處測定各實驗組 [50、100、200、400 mg/L HPS1 組；2.5、5、10、15 mg/L 吉 非 替 尼 組；HPS1 (50、100、200、400 mg/L)聯合吉非替尼5 mg/L 組]吸光度值。細胞活力用實驗組吸光度值占對照組 (完全培養(yǎng)液)吸光度值的百分比表示。

1.6 流式細胞術檢測 將細胞以1×106個/瓶的密度接種于培養(yǎng)瓶中,觀察細胞貼壁后換液,實驗分組：對照組(完全培養(yǎng)液)、HPS1組(200 mg/L)、吉非替尼組(5 mg/L)、HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組。作用24 h后消化細胞,1 500 r/min離心5 min,離心半徑29.9 cm,棄去上清液,PBS沖洗2次。再次1 500 r/min離心5 min,離心半徑29.9 cm 后收集細胞,緩緩加入適量-20 ℃預冷的70%乙醇溶液,1 500 r/min 離心5 min,離心半徑29.9 cm,PBS 洗滌2 次,收集細胞,加入10μl AnnexinⅤ-FITC 避光染色30 min,最后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期分布情況。細胞凋亡率 (%)=凋亡細胞計數/所有細胞計數×100%。

1.7 實時熒光定量PCR 法 細胞接種于培養(yǎng)瓶并融合至單層后,傾去原培養(yǎng)液,加入含各實驗濃度的完全培養(yǎng)液,實驗分組：對照組(完全培養(yǎng)液)、HPS1 200 mg/L組、吉非替尼5 mg/L 組、HPS1 50 mg/L+吉非替尼5 mg/L組、HPS1 100 mg/L+吉非替尼5 mg/L組、HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄去上清液,PBS沖洗2次,TRIzol法提取總RNA,分光光度法測定其純度及濃度。反轉錄試劑盒反轉錄各組細胞總RNA,生成cDNA,進一步用目的基因引物及內參β-actin行引物擴增 (表1)。PCR 結果由Rotor-Gene 6軟件分析,確定各反應樣本的Ct值,采用相對定量的2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量,分析各樣本之間目的基因的表達差異。

表1 RT-PCR 所用引物及相關參數

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學分析軟件處理各實驗數據。每個實驗組均設5個平行孔,數據用x-±s表示。組間比較采用單因素方差分析及t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT 實驗結果 MTT 法檢測結果顯示,HPS1各濃度組從6 h開始細胞活力下降,并持續(xù)到48 h。與對照組比較,HPS1各濃度組24、48 h細胞活力明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義 (P值均＜0.05),半數抑制濃度為205.5 mg/L。200 mg/L HPS1組與400 mg/LHPS1組在各時間段細胞活力比較差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。吉非替尼各濃度組在不同時間點 (6、24、48 h)對A549細胞均有抑制作用,其抑制作用呈現濃度、時間依賴性,半數抑制濃度為4.8 mg/L(圖1)。

HPS1 (50、100、200、400 mg/L)聯合吉非替尼(5 mg/L)組在不同時間段 (6、24和48 h)的細胞活力均較吉非替尼單獨處理 (5 mg/L)細胞活力降低,差異均有統(tǒng)計學意義 (P值均＜0.05),見圖1。

圖1 MTT 法檢測HPS1聯合吉非替尼對A549細胞增殖的抑制作用

2.2 流式細胞術檢測結果 各組細胞作用24 h后,HPS1 200 mg/L組及吉非替尼5 mg/L組細胞凋亡率均較對照組高[(3.13±0.20)%、 (14.65±0.41)%、 (0.03±0.01)%,P值均＜0.05),且HPS1 200 mg/L組及吉非替尼5 mg/L 組的G1+S 期細胞比例均較對照組升高 (97.22%、100.00%、91.07%,P值均＜0.05),而HPS1 200 mg/L組及吉非替尼5 mg/L組G2期細胞比例較對照組明顯降低 (2.78%、0.00%、8.94%,P值均＜0.05)；HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組細胞凋亡率較吉非替尼5 mg/L組高,差異有統(tǒng)計學意義[(28.72±1.08)%比(14.65±0.41)%,t=2.412,P＜0.05],2組G1+S期細胞比例均為100%。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測HPS1聯合吉非替尼對A549細胞周期分布和凋亡的影響 A：對照組；B：HPS1 200 mg/L組；C：吉非替尼5 mg/L組；D：HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組

2.3 RT-PCR 檢測結果 HPS1各濃度組及吉非替尼組的Bcl-2 mRNA 表達水平較對照組降低,差異均有統(tǒng)計學意義 (P值均＜0.05)；而HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組的Bcl-2 m RNA 表達較吉非替尼5 mg/L組降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=98.56、88.48,P值均＜0.05)。與之相反,HPS1各濃度組及吉非替尼組的Bax m RNA 表達水平較對照組明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義 (P值均＜0.05)；HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組Bax m RNA 的表達水平較吉非替尼5 mg/L 組升高,差異有統(tǒng)計學意義(t=37.75、51.02,P＜0.05)。見表2。

表2 RT-PCR 法檢測HPS1聯合吉非替尼對A549細胞Bax/Bcl-2 mRNA 表達的影響 (±s)

注：HPS1為紅芪多糖1；與對照組比較,a P ＜0.05；與吉非替尼5 mg/L組比較,b P ＜0.05

組別 Bax mRNA 相對表達量Bcl-2 mRNA 相對表達量對照組 1.00±0.00 1.00±0.00吉非替尼5 mg/L組 56.80±2.45a 0.21±0.02a HPS1 50 mg/L組 4.82±0.13a 0.78±0.02a HPS1 100 mg/L組 4.08±0.16a 0.53±0.03a HPS1 200 mg/L組 5.58±0.14a 0.31±0.02a HPS1 200 mg/L+吉非替尼5 mg/L組 58.80±3.43b 0.12±0.02b F 值 3.71 18.51 P 值 0.023 0.041

3 討論

吉非替尼是近十余年來在臨床應用較為廣泛的TKI藥物,已經被列為治療存在EGFR 基因突變的肺腺癌的一線藥物,然而臨床工作中對于TKI藥物的耐藥始終是困擾醫(yī)師及制約肺腺癌患者治療的最大因素。探討抑制或減緩TKI藥物耐藥的機制是目前抗腫瘤研究領域的熱點[4]。在此機制中,中藥輔助分子靶向藥物及化療藥物增強抗腫瘤作用越來越多的受到關注。本文立足于此,探討紅芪聯合分子靶向藥物吉非替尼的抗腫瘤作用機制。

中藥紅芪是甘肅省道地藥材。研究發(fā)現紅芪中提取出的生物活性物質HPS具有抗腫瘤作用[5-8],但其機制目前尚不十分清楚。課題組前期研究發(fā)現紅芪多糖作用于人肺腺癌A549 細胞,通過HPS誘導腫瘤細胞凋亡以及促使腫瘤細胞中Bcl-2/Bax比例下降,進而抑制其增殖,誘導凋亡[8-9]。在課題組后續(xù)研究過程中發(fā)現HPS抑制A549細胞增殖、誘導凋亡可能與調控細胞內氧化/抗氧化平衡機制有關[10]。本課題組在既往研究的基礎上,討論HPS1 聯合吉非替尼對人肺腺癌A549 細胞活力、凋亡的影響,為中藥輔助抗腫瘤治療及篩選新的抗腫瘤中藥提供理論基礎和實驗數據支持。

細胞增殖是指細胞在周期調控因子的作用下,嚴格通過DNA 復制、RNA 轉錄和蛋白質合成等復雜反應而進行的分裂系列過程。此前研究結果提示HPS1可抑制A549細胞增殖[10-11],本實驗在前期實驗基礎上更進一步,通過MTT 法檢測吉非替尼單獨及聯合HPS1各濃度組對A549細胞增殖的影響,發(fā)現HPS1聯合吉非替尼可提高吉非替尼對A549細胞增殖的抑制作用,有協(xié)同抗腫瘤作用。

細胞凋亡屬于細胞程序性死亡,是一種細胞生理性、主動性的自殺行為。細胞凋亡的信號傳遞途徑及調控機制復雜。目前認為細胞凋亡的發(fā)生主要有兩條信號傳導途徑,一條途徑為死亡受體通路,另一條途徑為線粒體信號通路。它們對細胞的正常代謝、增殖、分化、凋亡的調控具有重要的調控作用。調控異常是腫瘤發(fā)生的一個重要原因,因此通過阻滯細胞周期,或影響細胞周期的某一環(huán)節(jié),從而誘導腫瘤細胞凋亡,是抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制。本研究發(fā)現,HPS1和吉非替尼均可使A549細胞凋亡率增加,HPS1聯合吉非替尼組細胞凋亡率最高,且使細胞周期阻滯于G1和S期,從而抑制腫瘤細胞增殖,誘導細胞凋亡。這提示HPS1可增強吉非替尼誘導的A549細胞凋亡,這與此前相關報道吻合[11]。

Bax基因屬Bcl-2基因家族,是極重要的促細胞凋亡基因之一。研究發(fā)現,Bcl-2/Bax蛋白的比例大小是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素。體外研究發(fā)現,高表達的Bcl-2可抑制化療或放療誘導腫瘤細胞凋亡,是放化療失敗的主要原因[12]。本研究發(fā)現,HPS1聯合吉非替尼組Bcl-2/Bax比例下降較單用吉非替尼組更為顯著,提示HPS1可增強吉非替尼體外化療的作用。其途徑可能是通過調控Bcl-2與Bax的表達而誘導A549細胞凋亡和分化,抑制腫瘤細胞的增殖。另外有研究報道,HPS1還可以通過調節(jié)機體非特異性免疫而增強患者抗腫瘤能力[13]。綜上所述,HPS可增強吉非替尼的抗腫瘤作用,發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。其機制可能與調節(jié)腫瘤細胞表達Bcl-2/Bax 蛋白的比例有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突