李娜(河南知微生物醫(yī)藥有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000)

0 引言

阿托伐他汀鈣為他汀類血脂調(diào)節(jié)藥，是羥甲戊二酰輔酶(HMG-CoA)還原酶抑制劑，它主要通過抑制肝臟內(nèi)HMG-CoA還原酶來降低血漿中膽固醇和血清脂蛋白的濃度。主要適應(yīng)癥有原發(fā)性高膽固醇血癥、混合性高脂血癥[1]以及純合子家族性高膽固醇血癥。此類藥物具有選擇性好、療效高、副作用少等優(yōu)點，是目前治療高膽固醇癥的主導(dǎo)藥，也是心腦血管類藥物中最有前景的藥物[2-5]；4-氟-α-(2-甲基-1-氧丙基)-1-γ-氧-N，β-二苯基苯丁酰胺(M4)是合成阿托伐他汀鈣的一個關(guān)鍵中間體，其有關(guān)物質(zhì)A含量的高低直接影響著阿托伐他汀鈣的質(zhì)量。本文對其有關(guān)物質(zhì)A方法進(jìn)行優(yōu)化，建立了合適的檢測方法，該方法下雜質(zhì)峰形良好，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度好，能有效的控制M4中有關(guān)物質(zhì)A的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent高效液相色譜儀(DAD檢測器)，梅特勒MS105電子天平，梅特勒FE28酸度計。

1.2 試藥

有關(guān)物質(zhì)A對照品(5-VCP-20-1，來源：TRC)；M4樣品(5313-180421，5313-180424，5313-180425，來源：河南豫辰藥業(yè)股份有限公司)，乙腈：色譜級，其他試劑均為分析純，水為哇哈哈水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex F5(250×4.6mm，5μm)，柱溫40℃，流動相：5mmol/L磷酸二氫鉀溶液(pH3.0)：95%乙腈=45:55，流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl，檢測波長：220nm，稀釋劑：5mmol/L磷酸二氫鉀溶液(pH3.0)：乙腈=50:50；

2.2 溶液配制

(1)空白溶液：稀釋劑；

(2)供試品溶液：取M4樣品約20mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加約5ml乙腈使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻；

(3)對照溶液：精密量取供試品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻；

(4)分離度溶液：取M4樣品、有關(guān)物質(zhì)A對照品各適量，加適量乙腈使溶解，用稀釋劑稀釋制成每1ml含M4約0.4mg、有關(guān)物質(zhì)A約0.2μg的混合溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性

按“2.1”項下色譜條件，精密量取空白溶液、分離度溶液、供試品溶液、對照溶液各20μl，分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。分離度溶液中主峰保留時間10.669min，與相鄰雜質(zhì)峰分離度3.3，有關(guān)物質(zhì)A保留時間8.743min，與相鄰雜質(zhì)峰分離度2.2；對照溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，峰面積RSD為0.5%，理論塔板數(shù)為28700；空白溶液在M4及有關(guān)物質(zhì)位置無干擾。見圖1。

3 方法驗證結(jié)果

3.1 專屬性

取M4樣品適量，對其進(jìn)行酸(0.1mol/L鹽酸)、堿(0.1mol/L氫氧化鈉)、氧化(30% 過氧化氫)、高溫(60℃)、高濕(90%)、光照(4500lx)試驗考察，M4在酸、氧化、高溫、高濕、光照條件下比較穩(wěn)定，在堿條件下不穩(wěn)定，主峰降解7%，主峰純度為999，與相鄰峰分離度為3.3，有關(guān)物質(zhì)A未檢出，破壞前后物料守恒值為100.5%，專屬性良好。

3.2 線性考察

稱取M4、有關(guān)物質(zhì)A對照品各適量，加乙腈適量使溶解，用稀釋劑稀釋制成20%、50%、75%、100%、125%、150%限度溶液，精密量取各線性溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度(μg/ml)對峰面積進(jìn)行線性回歸。有關(guān)物質(zhì)A和M4線性方程分別為：y=40.5085x+0.1575，y=37.8623x-0.3562，R2分別為0.9992、0.9940，計算有關(guān)物質(zhì)A校正因子為0.93。結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)A 在0.038μg/ml～0.28μg/ml、M4 在0.041μg/ml～0.31μg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。

3.3 檢測限和定量限

取“3.2”項下線性貯備液，用稀釋劑逐步稀釋至S/N≈10時作為定量限，S/N≈3時作為檢測限。有關(guān)物質(zhì)A檢測限濃度為0.019μg/ml；定量限濃度為0.038μg/ml，6 針峰面積RSD 值為4.2%。

3.4 準(zhǔn)確度

圖1

取M4樣品約20mg，精密稱定(稱取9份)，置50ml量瓶中，加約5ml乙腈使溶解，分別精密加入有關(guān)物質(zhì)A貯備液(5μg/ml)1ml、2ml、3ml，相當(dāng)于限度濃度的50%、100%、150%(每個濃度3份)，用稀釋劑稀釋至刻度，作為加標(biāo)溶液；另配制每個加標(biāo)溶液的自身對照溶液。按加校正因子的主成分自身對照法計算回收率，3個濃度下回收率分別為106.4%、113.6%、108.4%，RSD為4.1%，結(jié)果均在80%～120%之間，RSD小于10%，方法準(zhǔn)確度良好。

3.5 精密度(重復(fù)性)

取M4(批號：5313-180421)供試品6份，按照“2.2”項下平行配制并測定，6份供試品溶液有關(guān)物質(zhì)A均未檢出，方法重復(fù)性良好。

3.6 溶液穩(wěn)定性

取“2.2”項下的供試品溶液、對照溶液、分離度溶液，室溫放置不同時間，分別進(jìn)樣測定。M4供試品溶液放置18h，有關(guān)物質(zhì)A均未檢出；對照溶液放置18h，峰面積RSD值為1.5%；分離度溶液放置8h，有關(guān)物質(zhì)A含量變化量為0.01%，穩(wěn)定性良好。

3.7 耐用性

取空白溶液、分離度溶液、供試品溶液、對照溶液(配制方法同“2.2”項下)分別在柱溫±2℃、流速±0.1ml/min、波長±2nm、流動相比例±2%、pH±0.2、不同型號色譜柱(Luna PFP)條件下進(jìn)行測定，各變動參數(shù)條件下，對照溶液6針峰面積RSD值最大為4.7%，分離度溶液有關(guān)物質(zhì)A、M4與相鄰峰分離度最小為2.0，M4供試品溶液有關(guān)物質(zhì)A均未檢出；方法耐用性良好。

3.8 樣品測定

取M4供試品(批號5313-180421, 5313-180424, 5313-180425)，按照“2.2”項下方法配制溶液并進(jìn)行測定，3批樣品中有關(guān)物質(zhì)A均未檢出。

4 結(jié)語

(1)流動相及柱子的選擇。有關(guān)物質(zhì)A是M4的同分異構(gòu)體，其與M4分離較差且峰形較差，故單獨開發(fā)M4中有關(guān)物質(zhì)A的檢測方法。M4的pKa為11.5，流動相初步選擇pH3.0的磷酸二氫鉀緩沖液-甲醇(40:60)，色譜柱為Ajilent SB-C18，該方法下，有關(guān)物質(zhì)A前伸嚴(yán)重；流動相更換為pH3.0的磷酸二氫鉀緩沖液-95%乙腈(50:50)，有關(guān)物質(zhì)A峰形明顯改善，峰形良好，但與M4其他有關(guān)物質(zhì)分離較差，調(diào)整流動相洗脫比例及考察Ajilent Plus-C18、EC-C18、XDB-C8柱子，分離度均無明顯改善；根據(jù)M4結(jié)構(gòu)特點，選用Phenomenex Kinetex F5(五氟苯基柱)，有關(guān)物質(zhì)A與M4其他有關(guān)物質(zhì)分離較好，故選擇F5柱子。

(2)波長的選擇。有關(guān)物質(zhì)A經(jīng)紫外掃描，其最大吸收波長為205nm，該波長下基線較差，對比220nm波長，基線良好，且滿足靈敏度檢測要求，故波長選擇220nm。

(3)稀釋劑的選擇。M4及有關(guān)物質(zhì)A在乙腈中溶解性較好，用乙腈作為稀釋劑時，發(fā)現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)A峰形較差，推測有溶劑效應(yīng)；稀釋劑更換為乙腈-水和乙腈-pH3.0的磷酸二氫鉀溶液，峰形變好，但有關(guān)物質(zhì)A在乙腈-pH3.0的磷酸二氫鉀溶液中較穩(wěn)定，故選擇稀釋劑為乙腈-pH3.0的磷酸二氫鉀溶液。

本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀鈣中間體M4的有關(guān)物質(zhì)A檢測方法，結(jié)果表明所建立的方法準(zhǔn)確、可靠，可用于M4的有關(guān)物質(zhì)檢測。控制好中間體M4的質(zhì)量是確保阿托伐他汀鈣有關(guān)物質(zhì)含量低的重要前提。本研究對于阿托伐他汀鈣原料藥的生產(chǎn)控制具有較重要的意義。