0 引言

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，Bray等[1]對全球185個國家36種癌癥進行統(tǒng)計分析顯示：胃癌每年新發(fā)病例約100多萬，約占癌癥新發(fā)病例6%，居惡性腫瘤中第六位。中國是胃癌高發(fā)國家，每年新發(fā)病例數(shù)約40萬，占全世界40%左右[2]。目前胃癌在全球范圍內(nèi)呈高發(fā)趨勢，主要集中于中國、日本、韓國等東亞國家，已經(jīng)嚴重威脅到了人類的健康[3]，探究促進胃癌發(fā)生發(fā)展的新機制，探索胃癌治療的新方法意義重大。

長鏈非編碼RNA（long-chain non-coding RNA,lncRNA）是長度在200～100 000 nt之間的RNA分子，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其在染色體沉默、染色質(zhì)表觀遺傳學(xué)修飾、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯及定位等各方面發(fā)揮了重要的作用[4]。據(jù)文獻報道：lncRNA FOXD2-AS1在結(jié)直腸癌[5]、食管癌[6]、肺癌[7]、肝癌[8]等多種癌癥中高表達，并參與腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲及化療抵抗等生物學(xué)過程。本研究通過臨床組織標本驗證lncRNA FOXD2-AS1的表達情況與患者臨床病理資料的關(guān)系，并在體外實驗中研究其在促進胃癌發(fā)展的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人正常胃癌上皮細胞系GES-1、人胃癌細胞系BGC-823、AGS、MGC-803、MKN45、MKN-74由湖南省中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗室饋贈，E-Cadherin（Cat:10204-MM08）及N-cadherin（Cat:11039-R020）抗體購自義翹神州有限公司、Vimentin抗體購自美國CST公司（#5741）、β-catenin（ab32572）及Cyclin-D1（ab16663）抗體購自美國Abcam公司，GAPDH（Cat:10494-1-AP）一抗購自美國Proteintech公司，鼠二抗及兔二抗均購自上海優(yōu)寧維生物公司，RPMI1640及胎牛血清（FBS）均購自于以色列BI公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RNA保護液及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000 Transfection Reagent購自美國賽默飛公司，lncRNA FOXD2-AS1小干擾RNA序列及對照序列均由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成，GAPDH及l(fā)ncRNA FOXD2-AS1引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 大數(shù)據(jù)應(yīng)用 在GEPIA在線數(shù)據(jù)庫中（http://gepia.cancer-pku.cn）分析LncRNA FOXD2-AS1在胃癌中的表達情況；從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載胃癌患者資料，分析lncRNA FOXD2-AS1的表達情況、在K-M在線分析數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com）分析lncRNA FOXD2-AS1的表達情況及與患者腫瘤分期關(guān)系。

1.2.2 胃癌組織RNA提取 選取2018年9月—2019年3月30例在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院行胃癌根治術(shù)患者新鮮標本，患者均知情同意，并獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。在標本離體30 min內(nèi)將標本收取并剪成1 mm3小塊置于RNA保護液中，放入液氮保存，提取RNA前將組織從液氮中取出，放入液氮預(yù)冷的研缽中研碎，參照RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA，并測定濃度，選取OD260/OD280值在1.9～2.1之間的RNA進行后續(xù)實驗，保證RNA的完整性，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA，細胞樣本RNA提取方法同上。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及分組 人胃癌細胞系BGC-823培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、1% 100 μg/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將人胃癌細胞系BGC-823分別轉(zhuǎn)染siRNA-A、siRNA-B以及siRNANC，分為siRNA-A組、siRNA-B組及siRNA-NC組。lncRNA FOXD2-AS1 siRNA-A序列正義鏈：5'-GCGAAGAGUACGUUGCUAUTT-3'；反義鏈：5'-AUAGCAACGUACUCUUCGCTT-3'；lncRNA FOXD2-AS1 siRNA-B序列正義鏈：5'-GUUCGAG AGUGAAUUUACATT-3'；反義鏈：5'-UGUAAA UUCACUCCUCGAACTT-3'；陰性對照序列正義鏈：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；反義鏈：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine3000 Transfection Reagent說明書及干擾序列說明書進行。

1.2.4 qRT-PCR實驗 提取組織及細胞樣本RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照qRT-PCR試劑盒說明書采用qPCR三步法進行實驗，實驗條件：在94℃預(yù)變性30 s，94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，進行40個循環(huán)擴增，利用GAPDH作為內(nèi)參，定量采用2-ΔΔCt法，計算胃癌各細胞系、癌組織與癌旁組織以及siRNA-A組、siRNA-B組及陰性對照組中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1相對表達量。GAPDH引物序列：上游引物：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'；下游引物：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'；lncRNA FOXD2-AS1引物序列：上游引物：5'-CCG CGTAAGCCTCATAGAAG-3'；下游引物：5'-GGG AGTAGGGTGAGGAAAGG-3'。

1.2.5 細胞增殖能力檢測 采用CCK8比色法測定lncRNA FOXD2-AS1 siRNA-A組、siRNA-B組及陰性對照組細胞增殖能力。將三組細胞以3 000個/孔種植于96孔板中，分別于培養(yǎng)0、24、48、72和96 h后，吸盡培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK8試劑的RPMI 1640溶液100 μl，2 h后在450 nm波長下，利用酶標儀測定吸光度，實驗重復(fù)三次，取平均值并繪制增殖曲線。采用平板克隆形成實驗檢測細胞增殖及克隆形成能力。胰酶消化，充分打勻并計數(shù)，6孔板中加入2 ml完全培養(yǎng)基，每孔加入400個細胞，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min后肉眼計數(shù)克隆數(shù)，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，實驗重復(fù)三次，取平均值。

1.2.6 細胞遷移能力測定 預(yù)先用記號筆在6孔板背后每隔0.5 cm劃一道線。培養(yǎng)人胃癌BGC-823細胞株至對數(shù)期，并按5×105個/孔接種于6孔板，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，第二天待細胞長滿，用200 μl槍頭垂直于畫線進行劃痕，并用PBS洗兩次，分別加入含無血清培養(yǎng)基，并于顯微鏡下拍照，記錄0 h劃痕位置及寬度，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后與0 h同一位置進行拍照，并計算劃痕愈合率，愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/（0 h劃痕寬度），實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7 細胞侵襲能力測定 采用Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，將三組細胞消化吹打勻，并用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，將細胞密度調(diào)整到1.5×104個/毫升，取200 μl細胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，PBS輕洗兩遍，用甲醇固定細胞，用棉簽擦拭掉上室細胞，將下室細胞采用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，染色30 min后顯微鏡200倍視野下，分別取左上、左下、右上、右下以及中間五個視野，計算穿膜細胞數(shù)，實驗重復(fù)三次，取平均值。

1.2.8 蛋白印跡（Western blot）實驗 提取lncRNA FOXD2-AS1 siRNA-A組、siRNA-B組及陰性對照組細胞總蛋白，裂解并變性，電泳條件：濃縮膠80 V至蛋白Marker分離后，加大電壓至溴酚藍跑至膠底；轉(zhuǎn)膜條件：300 mA轉(zhuǎn)80 min，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗，4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL液顯影，并計算灰度值，實驗重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件處理，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間兩兩比較經(jīng)單因素方差分析，若符合方差齊性正態(tài)性分布采用t檢驗，若不符合則用秩和檢驗，組間重復(fù)測量數(shù)據(jù)分析采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，率的比較或構(gòu)成比比較采用四格表卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA FOXD2-AS1在胃癌組織中的表達及與臨床病理因素的關(guān)系

GEPIA 數(shù)據(jù)庫在線分析顯示lncRNA FOXD2-AS1在胃癌組織中較癌旁組織中高表達（P=0.000），見圖1A；K-M（Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com））數(shù)據(jù)庫在線分析顯示：lncRNA FOXD2-AS1的表達與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)（P=0.000），見圖1B；取30例胃癌根治術(shù)患者標本提取RNA行qRT-PCR結(jié)果顯示：lncRNA FOXD2-AS1在癌組織中表達較癌旁組織顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），見圖1C。

我們以l ncRNA FOXD2-AS1中位表達量（2.883）為界，將患者分為lncRNA FOXD2-AS1高表達組及低表達組（每組各15例），并與患者臨床一般資料及病理資料比較，結(jié)果顯示lncRNA FOXD2-AS1的表達與腫瘤分期相關(guān)（P=0.025），與患者年齡、性別、腫瘤大小及浸潤深度無關(guān)（均P>0.05），見表1。

圖1 lncRNA FOXD2-AS1在胃癌組織中的表達及與患者預(yù)后的關(guān)系Figure 1 lncRNA FOXD2-AS1 expression in gastric cancer tissues and its relation with patients’ prognosis

表1 lncRNA FOXD2-AS1表達與胃癌患者臨床病理分期相關(guān)性Table 1 Correlation between lncRNA FOXD2-AS1 expression and clinicopathological stage of gastric cancer patients

2.2 lncRNA FOXD2-AS1在不同胃癌細胞系中的表達

qRT-PCR檢測lncRNA FOXD2-AS1在各細胞系中表達情況，將GES-1細胞系相對表達量設(shè)為1，計算各胃癌細胞系較GES-1細胞系lncRNA FOXD2-AS1相對表達量，實驗重復(fù)3次。qRT-PCR結(jié)果顯示：胃癌細胞系A(chǔ)GS、BGC-823、MGC-803、MKN-45、MKN-74細胞系相對表達量分別為2.43±0.14（P=0.000）、4.38±0.18（P=0.000）、1.73±0.08（P=0.001）、1.87±0.11（P=0.0002）、2.07±0.14（P=0.0002），各胃癌細胞系中l(wèi)ncRNA FOXD2-AS1相對表達量均明顯高于胃正常上皮細胞系GES-1（均P<0.05），其中BGC-823細胞系lncRNA FOXD2-AS1相對表達量最高，見圖2。

圖2 lncRNA FOXD2-AS1在不同胃癌細胞系中的表達Figure 2 lncRNA FOXD2-AS1 expression in different gastric cancer cell lines

2.3 lncRNA FOXD2-AS1基因沉默對胃癌細胞系BGC-823的增殖及克隆形成能力的影響

2.3.1 沉默效率驗證 BGC-823細胞轉(zhuǎn)染lncRNA FOXD2-AS1的小干擾RNA（siRNA-A、siRNA-B）及陰性對照序列（siRNA-NC）后，qRT-PCR驗證lncRNA FOXD2-AS1表達情況，結(jié)果顯示：將陰性對照組lncRNA FOXD2-AS1相對表達量設(shè)為1，與陰性對照組相比，F(xiàn)OXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組lncRNA FOXD2-AS1相對表達量為0.37±0.05（P=0.000）、0.30±0.02（P=0.000），說明兩組lncRNA FOXD2-AS1的沉默效率均大于60%，與陰性對照組相比顯著下降（均P<0.05），兩組siRNA均可為后續(xù)實驗所用，見圖3A。

2.3.2 CCK8結(jié)果 單因素方差分析顯示，轉(zhuǎn)染24 h內(nèi)各組OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.379），轉(zhuǎn)染48、72和96 h后，各組細胞OD值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000），且siRNA-NC組增殖速度較FOXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組明顯增快，見圖3B。

圖3 lncRNA FOXD2-AS1沉默效率驗證(A)、CCK8增殖實驗(B)及細胞平板克隆形成實驗(C)結(jié)果Figure 3 Results of lncRNA FOXD2-AS1 silencing efficiency verification(A),CCK8 proliferation experiment (B) and cell plate clone formation experiment(C)

2.3.3 平板克隆形成實驗結(jié)果 siRNA-NC組、FOXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組克隆形成數(shù)目分別為313.3±12.01、149.6±14.7、126.3±8.7個，克隆形成率分別約78.2%、37.5%和31.5%，經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），且siRNA-NC組克隆形成率明顯高于FOXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組，見圖3C。

2.4 lncRNA FOXD2-AS1基因沉默對胃癌細胞系BGC-823的遷移和侵襲能力的影響

2.4.1 劃痕實驗結(jié)果 siRNA-NC組、FOXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組24 h劃痕愈合率分別為（74.7±1.7）%、（49.7±2.2）%、（39.6±1.4）%，經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。且FOXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組劃痕愈合率明顯低于陰性對照組，見圖4A。

2.4.2 Transwell小室侵襲實驗結(jié)果 siRNA-NC組、FOXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組穿透基質(zhì)膠到達下室的細胞數(shù)分別為423.0±19.5、279.7±15.6、229.0±10.8，經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），F(xiàn)OXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組侵襲細胞數(shù)明顯少于陰性對照組，見圖4B。

圖4 劃痕實驗(A)和Transwell小室侵襲實驗(B)結(jié)果Figure 4 Results of wound healing assay(A) and Transwell test(B)

2.5 lncRNA FOXD2-AS1基因沉默對Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白及下游蛋白的影響以及對EMT相關(guān)蛋白的影響

qRT-PCR及Western blot實驗結(jié)果顯示：FOXD2-AS1 siRNA-A組與FOXD2-AS1 siRNA-B組中E-cadherin的表達較陰性對照siRNA-NC組顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），而N-cadherin、Vimentin、β-catenin與Cyclin D1的表達量較陰性對照siRNA-NC組均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000），見圖5 。

3 討論

研究報道多種lncRNA與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Xu等[9]報道lncRNAPVT1與FOXM1的正反饋調(diào)節(jié)調(diào)控胃癌的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。Yan等[10]發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG6通過沉默P27蛋白的表達以及吸附miR-101-3p來調(diào)節(jié)ZEB1表達從而促進胃癌細胞的增殖及EMT，影響胃癌患者的臨床預(yù)后。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)HNRNPKP2通過調(diào)控CXCR4的表達從而促進胃癌的肝轉(zhuǎn)移；影響胃癌發(fā)生發(fā)展的lncRNA還包括lncRNA ZFPM2-AS1[12]、lncRNA ELIT-1[13]、lncRNA LINC00346[14]等，lncRNA在胃癌增殖、細胞周期調(diào)控、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等方面都發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

圖5 沉默lncRNA FOXD2-AS1對Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白及EMT相關(guān)蛋白qRT-PCR實驗(A)和Western blot實驗(B)驗證結(jié)果Figure 5 Effect of lncRNA FOXD2-AS1 silencing on expression of Wnt/β-catenin pathway related proteins and EMT-related proteins detected by qRT-PCR(A) and Western blot(B)

lncRNA FOXD2-AS1在多種腫瘤中高表達，并與患者的病理分期及臨床預(yù)后密切相關(guān)。在肝癌中，lncRNA FOXD2-AS1可以通過招募EZH2到p27基因的啟動子上，調(diào)控p27基因表達，從而促進肝癌發(fā)展[15]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，lncRNA FOXD2-AS1可以吸附miRNA-185-5p，并通過PI3K/AKT通路促進腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[16]。lncRNA FOXD2-AS1作為一個重要的癌基因，在不同的癌癥中其作用也不盡相同。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXD2-AS1在胃癌組織中較癌旁組織中明顯升高，數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示其高表達與胃癌的預(yù)后相關(guān)，同樣在我們的樣本中發(fā)現(xiàn)其表達與胃癌的病理分期相關(guān)，這表明lncRNA FOXD2-AS1可能促進了胃癌的進展。進一步體外實驗研究發(fā)現(xiàn)：在胃癌BGC-823細胞系中抑制lncRNA FOXD2-AS1的表達可顯著抑制BGC-823細胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力。在進一步機制探索中我們發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA FOXD2-AS1的表達可以抑制N-cadherin與Vimentin的表達，促進E-cadherin的表達，同時抑制Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin以及下游蛋白Cyclin D1的表達，結(jié)果提示抑制lncRNA FOXD2-AS1可能通過抑制Wnt/β-catenin通路的激活，從而抑制胃癌細胞EMT的發(fā)生降低胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，研究結(jié)果與Huang等研究發(fā)現(xiàn)EphA2通過Wnt/β-catenin通路促進胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相符[17]。

本實驗尚存在一些不足之處：（1）在驗證胃癌組織及癌旁組織表達情況與患者病理分期時只收集了30例患者的標本及信息，樣本量較小，這也可能是導(dǎo)致lncRNA FOXD2-AS1的表達僅與臨床分期相關(guān)，而與腫瘤大小及浸潤深度無明顯差異的原因之一，后續(xù)實驗需進一步擴大樣本量；（2）lncRNA FOXD2-AS1調(diào)控Wnt/β-catenin通路的確切機制仍不清楚，還需進一步機制研究。

綜上所述，lncRNA FOXD2-AS1在胃癌組織及胃癌細胞系中高表達，與患者腫瘤臨床分期和預(yù)后相關(guān)，抑制其表達可通過抑制Wnt/β-catenin通路的激活，抑制胃癌細胞EMT的發(fā)生，降低胃癌細胞的增殖及遷移侵襲能力，lncRNA FOXD2-AS1可作為胃癌潛在的治療靶點及臨床預(yù)后標志物。