張李棟，李宏，陳軍，黃可，毛應華，榮曙，汪春暉

0 引言

惡性腫瘤是我國的常見病多發(fā)病[1]，是世界各地發(fā)病率和死亡率高的主要疾病[2]，傳統療法對惡性腫瘤的療效有限,并對機體造成嚴重的不良反應。近年來，光動力療法（PDT）成為腫瘤研究領域關注的熱點[3]，可以克服傳統療法存在的缺陷。PDT是通過光敏劑在特定波長激光照射下，與氧分子發(fā)生光敏作用產生大量單線態(tài)氧（1O2）和ROS，損傷靶細胞[4-5]，而腫瘤的缺氧微環(huán)境嚴重限制了PDT的發(fā)展。

近年來，納米藥物的發(fā)展提高了抗腫瘤藥物的療效，降低了腫瘤藥物的系統毒性[6]。其中，納米氧化鈰（Cerium oxide nanoparticles,CNPs）可以在腫瘤酸性微環(huán)境下發(fā)揮氧化作用殺傷腫瘤細胞，而在正常細胞的生理pH下，則發(fā)揮抗氧化劑保護效應。Pirmohamed等[7]發(fā)現CNPs具有過氧化氫酶模擬活性，可以催化腫瘤微環(huán)境中的H2O2生成O2，提高PDT的療效[8]。納米技術的發(fā)展開啟了光動力療法的新時代[5]，通過CNPs加載光敏劑進行惡性腫瘤的光動力學治療將是一種很好的抗腫瘤策略。然而，未經表面修飾的CNPs由于容易團聚、易被ERS清除、肝細胞毒性等缺點限制了其臨床應用。Zeng等[9]合成了透明質酸介導的多功能納米氧化鈰復合材料（HACQDs-Ce6），提高了CNPs顆粒的穩(wěn)定性，降低對人正常肝細胞的毒性，但其是否對肝癌細胞有毒性作用并未進行探討。

鑒此，本文進一步研究了多功能納米氧化鈰復合材料（HACQDs-Ce6）對肝癌細胞HepG2的光療效應，同時從BALB/c小鼠中誘導分化出骨髓源樹突狀細胞（BMDC），探究HACQDs-Ce6對DC細胞可能造成的影響，并用皮膚成纖維細胞HFF-1、小鼠皮下結締組織細胞L Wnt-3A進一步評估了HACQDs-Ce6材料的安全性，為惡性腫瘤的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

HACQDs-Ce6（由陸軍軍醫(yī)大學復合傷研究所惠贈），Anti-CD11c-FITC（Invitrogen公司，美國），重組GM-CSF和重組IL-4（Invitrogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞HepG2、人皮膚成纖維細胞HFF-1、小鼠皮下結締組織細胞L Wnt-3A購自中國科學院細胞庫，細胞用含10%胎牛血清（FBS）（Invitrogen公司，美國）、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國），在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 HACQDs-Ce6的催化產氧能力測定 取30 ml 0.1 mol/L H2O2放入50 ml離心管中，氮氣吹干儀通入N2排除溶液中的溶解氧。HACQDs-Ce6組加入1 ml HACQDs-Ce6，對照組加入1 ml PBS。加入10 ml食用油隔絕空氣，溶解氧儀每隔20 min測定溶解氧并記錄。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 取對數生長期的HepG2/HFF-1/L Wnt-3A/DC細胞，按1×104個/孔接種于96孔板中，孵育24 h后每孔加入5 μl不同濃度的HACQDs-Ce6，使材料中Ce的當量濃度分別為：0、0.125、1.25、12.5和125 μg/ml，孵育24 h后用PBS清洗3遍，更換培養(yǎng)基。光照組細胞用660 nm NIR（200 mW/cm2）照射5 min，黑暗組不作處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加10 μl CCK-8溶液，1 h后測定450 nm處各孔吸光度（OD）值。

1.2.4 劃痕實驗檢測HACQDs-Ce6對HepG2細胞遷移的影響 HepG2細胞按1×105個/孔接種于6孔板中，孵育24 h后用10 μl無菌吸管尖端刮除融合單層細胞，PBS清洗2遍。實驗組加50 μl HACQDs-Ce6，對照組加等體積PBS。24 h后PBS清洗3遍，更換培養(yǎng)基。光照組細胞用660 nm NIR（200 mW/cm2）照射5 min，黑暗組不作處理。劃痕后0、24和48 h對細胞進行拍照，計算創(chuàng)面愈合率，觀察各組細胞創(chuàng)面愈合情況。創(chuàng)面愈合率計算：愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積。

1.2.5 活死細胞染色 HepG2細胞按1×105個/孔接種于6孔板中，過夜貼壁；實驗組加入50 μl HACQDs-Ce6，對照組加等體積PBS；孵育24 h，取10 μl Calcein AM（1 mg/ml）及15 μl PI（1 mg/ml）溶液，加入5 ml PBS配制成工作液；各孔加入400 μl工作液混勻，37℃下避光孵育20 min，熒光倒置顯微鏡觀察并拍照（Calcein AM:Ex/Em=490/515 nm；PI:Ex/Em=535/617 nm）。

1.2.6 骨髓源樹突狀細胞（BMDC）誘導培養(yǎng) 取BALB/c雌性小鼠的股骨和脛骨，依次浸泡于無菌PBS 2 min，RPMI1640培養(yǎng)液（3倍青鏈霉素混合液）5 min，骨髓細胞懸液用200目細胞篩過濾后離心10 min（1 200 r/min），棄上清液，紅細胞裂解液裂解3 min，棄上清液，RPMI1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、rm GM-CSF（20 ng/ml）、rmIL-4（10 ng/ml）重懸細胞），以2×106個/孔接種于6孔板中。培養(yǎng)48 h后棄懸浮細胞，隔天半量換液，5天后收集懸浮細胞即為樹突狀細胞（DCs）。

1.2.7 骨髓源樹突狀細胞（BMDC）的鑒定 收集懸浮DC細胞，離心5 min（1 200 r/min），棄上清液，PBS重懸細胞，調整濃度至1×107個/毫升，每管加入100 μl細胞懸液，加入5 μl Anti-CD11c-FITC抗體，空白組不作處理，4℃下避光孵育30 min，孵育完畢后PBS清洗3遍，流式細胞儀上機檢測。

1.3 統計學方法

用SPSS16.0軟件包進行統計分析，以三次實驗結果的均數±標準差（）表示，兩組均數間比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HACQDs-Ce6的體外催化產氧能力

溶解氧儀測定結果顯示，HACQDs-Ce6組的溶解氧顯著高于PBS組，差異有統計學意義（P<0.001），見圖1。

圖1 HACQDs-Ce6體外催化產氧能力Figure 1 Catalytic oxygen production capacity of HACQDs-Ce6 in vitro

2.2 HACQDs-Ce6結合PDT對HepG2/HFF-1/L Wnt-3A細胞生長的影響

HepG2細胞活力隨著HACQDs-Ce6濃度的增加而下降；HACQDs-Ce6濃度>0.125 μg/ml時，光照組與黑暗組差異有統計學意義（P=0.018）；黑暗條件下HACQDs-Ce6對HFF-1/L Wnt-3A細胞活力幾乎無影響（均P>0.05），見圖2。

2.3 HACQDs-Ce6結合PDT對HepG2細胞遷移的影響

培養(yǎng)24 h后，PBS和HACQDs-Ce6組中HepG2細胞劃痕愈合率為（10.77±0.21）%和（7.48±0.19）%，組間差異有統計學意義（P=3.4E-5）；光照后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,PBS和HACQDs-Ce6組中HepG2細胞劃痕愈合率為（21.54±0.29）%和（9.20±0.56）%，組間差異有統計學意義（P=4E-6）；HACQDs-Ce6結合PDT的條件下，HepG2細胞遷移能力明顯下降，見圖3。

2.4 HACQDs-Ce6對HepG2細胞存活狀態(tài)的影響

HACQDs-Ce6和PDT聯合作用下，幾乎能殺死所有HepG2細胞，見圖4。

2.5 BMDC的誘導培養(yǎng)及鑒定

采用IL-4和GM-CSF聯合誘導BMDC，骨髓源單核細胞逐漸變大，表面變粗糙。從懸浮到貼壁再到懸浮，收集DC。流式鑒定結果CD11c陽性純度達到96.5%，見圖5～6。

圖2 CCK-8檢測HepG2/L Wnt-3A/HFF-1細胞的生長情況Figure 2 Growth of HepG2,L Wnt-3A and HFF-1 cells detected by CCK-8

圖3 劃痕實驗檢測HepG2細胞的遷移情況 (×100)Figure 3 Migration of HepG2 cells detected by wound scratch assay (×100)

圖4 Calcein AM/PI細胞雙染熒光圖像 (×100)Figure 4 Double staining fluorescent images of living(green)/dead (red) cells by Calcein AM/PI (×100)

圖5 骨髓源樹突狀細胞的誘導培養(yǎng) (×200)Figure 5 Induction culture of bone-marrow-derived dendritic cells (×200)

圖6 骨髓源樹突狀細胞的鑒定Figure 6 Identification of bone-marrow-derived dendritic cells

2.6 HACQDs-Ce6對DC細胞的影響

結果表明黑暗條件下不同濃度的HACQDs-Ce6對DC細胞活力幾乎無影響（P>0.05），見圖7。

圖7 CCK-8檢測樹突狀細胞的生長情況Figure 7 Growth of dendritic cells detected by CCK-8

3 討論

癌癥發(fā)病率和死亡率的普遍上升導致了人們對有效和安全的治療材料的渴望[10]。光動力學療法（PDT）是一種基于活性氧（ROS）誘導的臨床癌癥治療模式[11]，具有組織特異性強、不良反應小等優(yōu)點[12]。納米技術的發(fā)展使光動力學療法在腫瘤治療方面取得了實質性進展，基于納米材料的PSs載藥系統逐漸成為PDT研究領域關注的熱點。腫瘤酸性微環(huán)境下，CNPs可誘導腫瘤細胞發(fā)生氧化應激，導致細胞膜破裂，從而殺傷細胞。此外，CNPs具有強大的儲氧能力和過氧化氫酶模擬活性，極大的提高了PDT的治療效應。

前期，Zeng等[9]已經發(fā)現HACQDs-Ce6對正常肝細胞（LO2）無毒性作用，在此基礎上，本課題進一步研究了HACQDs-Ce6對肝癌細胞HepG2的光療效應。結果顯示HACQDs-Ce6結合PDT幾乎能夠殺死大部分HepG2細胞，且對正常細胞無毒性作用，有望解決傳統治療方法的不良反應大、治療效果不明顯等缺陷，為惡性腫瘤患者的治療提供一種新的策略。

雖然HACQDs-Ce6的光療效應表現出很好的抗腫瘤效應，但該治療方案依舊存在兩點不足：第一，由于激光組織穿透性較差，臨床上對深層腫瘤進行有效的光照依舊困難；第二，CNPs的載氧能力有限，其O2的儲備無法滿足多輪PDT的治療。因此，如何更好的將該材料進一步應用于臨床，為腫瘤患者提供新的治療策略還有待進一步探索。