晏峰 周穎 戴數 任振喚

酒精（乙醇，ethanol，EtOH）是最常見的濫用物質，經調查發(fā)現(xiàn)長期酗酒者可致高血壓、精神失常、肝臟和胃受損等多種疾患[1]，故酒精攝入的毒性反應對機體各個系統(tǒng)的功能存在復雜影響，從各系統(tǒng)比較來看，血液系統(tǒng)中以外周血象的變化表現(xiàn)最為敏感[2]。研究證實酒精對紅細胞毒性歸因于活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生增加[3-4]，ROS參與多種過程，如衰老和疾病[5]。ROS的增加可能導致氧化應激和紅細胞成分的氧化，引起結構和功能改變，從而誘導細胞損傷和細胞死亡[6]。甘菊是一種屬菊科的藥用植物，以往實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，其大部分藥理作用與抗氧化活性有關，這主要是由于其具有清除自由基和（或）抑制脂質過氧化的能力[7-8]。筆者擬從乙醇對紅細胞的細胞毒性方面入手，探討甘菊提取物（chamomile decoction extract，CDE）對紅細胞的保護作用，以抗壞血酸作為CDE的藥效評價，為有效分析、預防及治療乙醇對紅細胞毒性損傷提供新方向。

1 對象和方法

1.1 對象 選取本院急診科2017年9月至2018年5月收治的急性酒精中毒患者256例，男157例，女99例，年齡 25耀59（40.96依12.83）歲；同時選取本院同期健康體檢者85例作為對照組，男50例，女35例，年齡22耀57（38.75依11.79歲），均無貧血及其他血液系統(tǒng)疾病，無急性感染、無飲酒習慣。全部對象均獲知情同意，并經本院醫(yī)學倫理委員會批準。兩組對象性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器和試劑 儀器：（1）美國coulter LH750 analyzer全自動血液分析儀及儀器配套稀釋液、溶血劑、清潔液；（2）美國Agilent 7890型頂空氣象色譜儀；（3）上海儀器總廠723型分光光度計；（4）美國BECKMAN AU5821型全自動生化分析儀。試劑：抗壞血酸購自天津市化學試劑一廠；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（cata原lase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxi原dase，GSH-Px）巰基（sulfhydryl，-SH）測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集和檢測 所有研究對象收治后抽取靜脈血8 ml，其中2 ml用EDTANa2抗凝，用于血常規(guī)檢測，2 h內完成；2 ml與枸櫞酸鈉9:1混勻，用于滲透脆性實驗；其余EDTANa2抗凝用于血液中乙醇含量及紅細胞生化指標測定，血液中乙醇含量使用頂空氣相色譜法檢測；723分光光度計用于50%溶血百分率檢測；酶活性檢測在生化分析儀上進行。

1.3.2 溶液配制

1.3.2.1 CDE溶液配制 分別稱取1 g CDE，加入100滋l二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）使其充分溶解后加入甲醇配成1 000 mg/L的CDE原液，給藥時用甲醇加以稀釋，配制成終濃度為25、50、100 mg/L的不同稀釋液。抗壞血酸溶液亦按上述方法配制成終濃度為200 mg/L。

1.3.2.2 乙醇不同濃度紅細胞懸液的配制 收集0 mg/100 ml、10 mg/100 ml、80 mg/100 ml、100 mg/100 ml、200 mg/100 ml急性酒精中毒患者的抗凝全血，3 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，加1豫氯化鈉溶液洗滌 2次，將細胞稀釋成 l伊l06個/ml，備用。

1.3.2.3 乙醇不同時間紅細胞懸液的配制 收集乙醇含量為80 mg/100 ml的急性酒精中毒患者的抗凝全血，孵育 12、24、36、48、60 h 后 3 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液，加1豫氯化鈉溶液洗滌2次，將細胞稀釋成 1伊l06個/ml，備用。

1.3.3 滲透脆性試驗 取試管14只，按表1編號排列，加入試劑和紅細胞進行滲透脆性試驗，具體步驟如下，輕輕混勻，置室溫2 h，然后2 000 r/min離心5 min，沉淀觀察結果。上清液出現(xiàn)透明、紅色，管底有紅細胞沉淀管為開始溶血管；管底無紅細胞沉淀管為完全溶血管。

1.3.4 溶血百分率計算 以510 nm比色，第1管為空白管，第14管NaCl濃度為0.1豫作為完全溶血管。其他各管上清液的吸光度與第14管上清液的吸光度比較，算出其溶血百分率。溶血百分率（%）=A測定管/A完全溶血管 伊100%。

表1 紅細胞滲透脆性試驗操作步驟（ml）

1.3.5 紅細胞滲透脆性曲線繪制 以溶血百分率為縱坐標、NaCl濃度為橫坐標，繪制紅細胞鹽水滲透脆性曲線，在曲線上找出50豫溶血百分率的NaCl濃度，其結果為滲透中數（MCF）。

1.3.6 預處理及酶活性測定 第1管選取乙醇含量為0 mg/100 ml者作為對照組，加入雙蒸水及與2-6管乙醇等體積的0.9%氯化鈉；2～6管乙醇含量為80 mg/100 ml，設定第2管為乙醇毒性損傷組，加入雙蒸水；3～5管加入不同劑量 CDE（終濃度分別為 25、50、100 mg/L），第6管加入200 mg/L抗壞血酸。第3～6管預處理4 h，第6管作為陽性對照。溶血后3 000 r/min離心5 min，取上清液檢測紅細胞 MDA、-SH基團含量和 SOD、CAT、GSH-Px活性。

1.3.7 紅細胞 MDA、-SH含量測定和 SOD、CAT、GSH-Px活性檢測 MDA含量檢測采用硫代巴比妥酸（Thibabituric Acid，TBA）法檢測，結果以 pmol/mg protein表示；-SH基團含量檢測采用分光光度法檢測，結果以nmol/mg protein表示；SOD活性檢測采用四氮唑藍（NBT）法檢測，結果以U/mg protein表示；CAT活性檢測采用紫外吸收法檢測，結果以nmolH2O2/min·mg protein表示；GSH-Px活性檢測采用酶促法測定，結果以nmol GSH/min·mg protein表示。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料組間比較采用字2檢驗，等級資料的比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 急性酒精中毒患者與對照組血常規(guī)結果的比較 進行不同乙醇濃度血樣外周血檢測變化，發(fā)現(xiàn)急性酒精中毒患者血液中的WBC、PLT低于對照組，淋巴細胞百分比（LY）、平均紅細胞容積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）值明顯高于對照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見表 2。

2.2 乙醇對紅細胞滲透脆性影響的檢測結果

2.2.1 乙醇攝入量對紅細胞滲透脆性影響 隨著乙醇含量的增加，紅細胞滲透脆性逐漸增加，乙醇組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），不同乙醇含量組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量效應。見表3。

2.2.2 乙醇孵育時間對紅細胞滲透脆性影響 乙醇組紅細胞滲透脆性隨孵育時間的延長逐漸增加，乙醇組與同一時段對照組相比，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）：乙醇組不同孵育時間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并呈現(xiàn)時間效應。見表4。

2.3 乙醇和CDE對紅細胞脂質氧化的影響 紅細胞脂質氧化以MDA表示。乙醇攝入量過多增加紅細胞MDA水平（圖1）。然而經過CDE預處理后顯示以劑量依賴性地逆轉乙醇中毒引起的脂質過氧化（P＜0.01）。

2.4 乙醇和CDE對紅細胞-SH基團含量的影響 本研究顯示乙醇攝入顯著降低-SH基團含量（圖2），CDE預處理顯著并劑量依賴性地減緩紅細胞由于乙醇的氧化應激引起的消耗（P＜0.01）。

2.5 乙醇和CDE對紅細胞抗氧化活性作用的影響酶研究發(fā)現(xiàn)乙醇和CDE對紅細胞抗氧化酶活性有較大影響（圖3）。說明乙醇攝入顯著降低紅細胞抗氧化酶活性SOD（a）、CAT（b）和 GPx（c）（P＜0.01）。CDE 預處理明顯逆轉所有乙醇誘導的抗氧化劑酶消耗，并且以劑量依賴方式保護紅細胞免于乙醇的氧化（P＜0.01）；同時發(fā)現(xiàn)抗壞血酸（抗氧化物質），也表現(xiàn)出同樣的保護方式。

表2 急性酒精中毒患者與對照組血常規(guī)結果的比較

表3 不同乙醇含量對紅細胞滲透脆性影響的檢測結果

圖1 乙醇（EtOH）和甘菊提取物（CDE）對丙二醛（MDA）的影響（AA為抗壞血酸；與對照組相比，*P＜0.01；與乙醇毒性損傷組相比，△P＜0.05）

圖2 乙醇（EtOH）和甘菊提取物（CDE）對-SH的影響（AA為抗壞血酸；與對照組相比，*P＜0.01；與乙醇毒性損傷組相比，△P＜0.05）

圖3 乙醇（EtOH）和甘菊提取物（CDE）對SOD、CAT和GPx活性的影響（a：SOD；b：CAT；c：GPx；AA 為抗壞血酸；與對照組比較，*P＜0.01；與乙醇毒性損傷組比較，△P＜0.05）

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)隨著飲酒頻率和飲酒量的增加，紅細胞和Hb水平趨于越來越高，顯示乙醇對紅細胞生成和生理活性有不同程度的影響[9]；另有研究發(fā)現(xiàn)乙醇攝入可引發(fā)全身（血液血漿）和局部水平（紅細胞）的氧化應激和脂質過氧化的激活[10]，導致紅細胞代謝活動出現(xiàn)障礙[11]。本研究亦證實，隨著乙醇含量的增加和乙醇續(xù)存時間的延長，紅細胞滲透脆性明顯降低，這可能與乙醇致紅細胞膜組分、膜功能改變有關[12]，而這種變化會導致膜流動性降低、變形性下降，即紅細胞通過微小血管的能力降低，導致組織灌注不足[13]，影響臟器的正常生理功能，因此認為乙醇攝入量、時間不同對外周血或機體有影響[9]。

相關研究顯示乙醇誘導組織氧化應激表現(xiàn)在許多器官如肝、腎、心臟、腦、和紅細胞等[14-17]。乙醇代謝消耗過程中，通過相關機制氧化應激產生ROS[18]，ROS是一類含有未配對電子的氧原子或氧原子團，會攻擊包括紅細胞在內生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化，產生MDA[19-20]，MDA極易與細胞膜磷脂、蛋白質等發(fā)生羰-氨交聯(lián)反應,具有強生物毒性的羰基化合物，造成細胞膜結構的破壞和生理功能的喪失，最終導致細胞凋亡和老化死亡[21-22]。因此當紅細胞MDA含量增加，表明紅細胞抗氧化防御能力下降，間接證實機體細胞受自由基攻擊，出現(xiàn)氧化應激狀態(tài)[18]。本研究證實，乙醇誘導的紅細胞氧化應激狀態(tài)可通過CDE預處理后得到緩解，因此認為CDE可以在一定程度上保護紅細胞脂質氧化。

在紅細胞膜上，-SH大量存在于多種功能蛋白中，而且多種代謝酶類都以包含-SH的半胱氨酸作為必須氨基酸。在氧化應激狀態(tài)下，-SH易發(fā)生自氧化交聯(lián)形成二硫鍵-S-S-，使蛋白分子內或分子間交聯(lián)[23]，導致多種蛋白及酶的功能降低或失活，最終導致紅細胞結構破壞和功能紊亂[10]。已有研究表明[24-25]，人紅細胞膜蛋白-SH水平在維系紅細胞功能的過程中起著至關重要的作用，蛋白-SH交聯(lián)所導致多種膜蛋白的損傷是紅細胞結構和功能性損傷的重要原因。本研究中，乙醇攝入組紅細胞膜-SH含量顯著降低（P＜0.01），一方面，表明紅細胞膜蛋白通過膜上大量-SH基團抵抗氧化損傷能力的降低；另一方面，也意味著紅細胞膜蛋白發(fā)生了結構上的改變。本研究結果顯示，CDE在一定程度上顯著提高紅細胞-SH含量，顯著保護相關酶活性，提示CDE通過抑制-SH的氧化，阻止膜蛋白交聯(lián)可能是對紅細胞的保護作用機制之一[7-8]。

乙醇代謝消耗過程中氧化應激產生ROS[18]。ROS對細胞生物大分子（如脂類、蛋白質、DNA）有潛在的氧化損傷能力，具有很強的化學反應活性[26-27]。正常情況下，由于機體內存在大量抵抗和消除自由基損傷的機制，ROS不會引起組織器官的損傷[28]。紅細胞內存在酶類和非酶類抗氧化物在內的抗氧化體系[29]，SOD、CAT和GSH-Px是體內主要的抗氧化酶，3者之間共同形成體內抗氧化保護系統(tǒng)，對細胞有一定的保護作用[10]。當紅細胞受到氧化損傷時，機體內ROS產生過多，不能被及時清除，SOD、CAT和GSH-Px活性降低，無法繼續(xù)抵御持續(xù)產生的ROS，加重細胞損傷。本研究顯示，CDE能夠有效改善以上3種抗氧化酶的活性，降低ROS的產生，提示CDE能夠阻斷氧自由基對紅細胞的破壞，起到抗氧化作用。

綜上所述，CDE對乙醇致氧化損傷人紅細胞具有保護作用，其保護作用機制可能是通過對抗氧自由基，抑制脂質過氧化、保護細胞膜蛋白上的巰基與細胞內抗氧化酶活性來實現(xiàn)的，CDE高劑量組對人紅細胞的預保護作用與抗壞血酸大體相當。