王昕晨 黃燕燕 陸暢暢 周吉航 何劍營 方可欣 樂涵波 續(xù)力云

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一，在肺癌的組織學分類中，肺鱗癌占了較大比例[1]。目前肺鱗癌患者的靶向治療靶點非常有限[2]，因此，尋找肺鱗癌相應的治療靶點成為學者們研究的熱點。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，從酵母到哺乳動物均廣泛存在。它作為一種主要的生長調(diào)節(jié)分子，可以感受并結(jié)合氨基酸、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子和環(huán)境信號等，以調(diào)節(jié)細胞各個過程，包括蛋白質(zhì)合成、生長、代謝、衰老、再生、自噬等。目前發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切，例如在宮頸癌[3]、結(jié)腸癌[4]等惡性腫瘤中表達變化明顯。本研究對mTOR信號通路相關(guān)分子在肺鱗癌組織中的表達情況及其與臨床病理特征及生存期的相關(guān)性作一探討，以期為治療肺鱗癌提供新的靶點。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2010年6月至2017年12月在本院經(jīng)手術(shù)病理檢查證實的肺鱗癌標本共93例?；颊呤中g(shù)前均未接受放療或化療。收集患者病史資料，如年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期等。腫瘤組織學分級是以2004年WHO肺癌組織學分類為基礎(chǔ)。按照國際抗癌聯(lián)盟倡導的TNM進行分類。所有標本均經(jīng)2位病理學主任醫(yī)師明確診斷。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 mTOR抗體（1:2 000）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）抗體（1:2 000）、P70核糖體蛋白 S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）抗體（1:2 000）、10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）抗體（1:25）、真核細胞翻譯起始因子 4E 結(jié)合蛋白 1（4E blinding protein1，4EBP1）抗體（1:2 400）、磷酸化真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（phosphorylated 4E blinding protein1，p-4EBP1）抗體（1:2 000）均購于美國Cell signaling technology公司，磷酸化P70核糖體蛋白S6激酶（phosphorylated ribosomal protein S6 kinase，p-p70S6K）抗體（1:2 000）購于美國Santa Cruze biotechnology公司。

1.3 肺鱗癌組織中mTOR信號通路相關(guān)分子檢測 采用免疫組化方法。收集石蠟包埋組織后置于切片機中進行連續(xù)切片。石蠟切片脫水脫蠟后，在檸檬酸緩沖液中進行熱修復，3% H2O2室溫孵15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。正常山羊血清封閉15 min后，分別滴加相應的抗體；另外，用PBS緩沖液替代上述抗體作為陰性對照。用免疫組化試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）進行二抗孵育，DAB顯色，之后用蘇木精對玻片進行染色，最后用樹脂封片。免疫組化結(jié)果采用雙盲顯微鏡進行判斷。染色強度分為 0（無）、1（弱）、2（中）、3（強）。陽性細胞所占比例為 0（無染色）、1（＜1/4染色）、2（1/4～3/4染色）、3（＞3/4染色）。組織學評分是細胞陽性強度和陽性細胞所占比例的乘積。免疫組化染色結(jié)果分為兩組，0～2為低表達病例組，＞2為高表達病例組。如出現(xiàn)結(jié)果不一致，則由第3位病理學醫(yī)師讀片后判斷結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料的比較采用字2檢驗和Fisher精確概率法?；颊哒w生存期（OS）采用GraphPad prism 5軟件，用Kaplan-meier法進行計算。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 mTOR信號通路相關(guān)分子表達水平與肺鱗癌臨床病理特征的關(guān)系分析 在肺鱗癌中，對mTOR信號通路分子與臨床病理特征進行單因素分析顯示，和低表達病例組相比，4EBP1高表達病例組在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所占比例為47.5%（29/61），而4EBP1低表達病例組在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中所占比例僅為12.5%（4/32），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且4EBP1高表達病例組中分期大于域期的比例較高（P＜0.05）；而該分子的表達水平在性別、是否吸煙、癌胚抗原水平、胸膜是否侵犯、腫塊直徑大小等臨床病理特征中，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。和高表達病例組相比，PTEN低表達病例組在腫瘤直徑＞3 cm的比例較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1（插頁）；而該分子高表達在性別、是否吸煙、CEA水平、胸膜是否侵犯、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等病理特征中，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。而p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、p70s6K信號分子的表達水平在不同臨床病理特征中差異均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。見表1。

圖1 肺鱗癌組織中10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）和真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）的表達（a：PTEN在肺鱗癌組織低表達；b：PTEN在肺鱗癌組織中高表達；c：4EBP1在肺鱗癌組織低表達；d：4EBP1在肺鱗癌組織高表達；DAB染色，×400）

表1 mTOR相關(guān)分子與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

表1 mTOR相關(guān)分子與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.2 肺鱗癌中mTOR信號通路相關(guān)分子的表達水平與生存時間的關(guān)系 與低表達病例組比較，p-mTOR信號分子高表達病例組的OS（35.0個月比75.0個月）明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2；而mTOR、p-4EBP1、4EBP1、p-p70s6K、p70s6k、PTEN 信號分子的表達與肺鱗癌患者OS均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。

圖2 磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的表達與肺鱗癌患者生存期的分析

3 討論

肺癌是當今全球常見的惡性腫瘤之一，而且近年來其在全世界的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)不斷上升趨勢[5]，5年生存率僅為15%[6]，肺鱗癌又是肺癌中常見的組織學類型，隨著分子生物學研究的不斷進展，針對相應靶點的分子靶向藥物已經(jīng)取得較好的療效[7]。探索肺鱗癌的分子生物學機制不僅可以提高臨床治療的效果，而且對肺鱗癌的早期診斷、臨床分期、預后判斷有著重要的作用。

mTOR編碼的大分子蛋白由2 549個氨基酸組成，分子質(zhì)量289 kDa，其定位于人類1號染色體短臂（1p，36.2），mTOR是在分析不同啤酒酵母突變體對雷帕霉素抵抗作用的差異時發(fā)現(xiàn)，在各種真核生物細胞中廣泛存在。它是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇激酶家族成員，在協(xié)調(diào)細胞生長和細胞死亡之間的平衡中扮演著至關(guān)重要的角色[8]。近年來，mTOR信號通路被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中如乳腺癌、胃癌、肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用[9-11]。

本研究中93例肺鱗癌組織分別用mTOR信號通路的 7種相關(guān)抗體（p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1、p-p70s6K、p70s6K、PTEN）進行免疫組化染色，通過各種抗體的表達水平探討其與腫瘤的關(guān)系。PTEN蛋白，它是一種早期發(fā)現(xiàn)的抑癌基因[12]，具有磷酸酯酶的活性，可通過酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性從而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[13]。董杰等[14]發(fā)現(xiàn)，PTEN在上皮性卵巢癌組織中的陽性表達率低于卵巢良性腫瘤，玉～域期上皮性卵巢癌組織中的陽性表達率明顯高于芋～郁期上皮性卵巢癌組織。徐曉燕等[15]在對肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中PTEN蛋白的表達顯著低于正常肺組織。本研究結(jié)果表明，在腫瘤直徑＞3 cm的組織中，89.1%患者PTEN呈明顯低表達，提示PTEN的低表達與腫瘤的生長有關(guān)。

4EBP1是mTOR信號通路激活后的關(guān)鍵下游調(diào)控因子，是目前研究最為廣泛的底物[16]，相對分子量為21 000，位于染色體8 p11.23位點上，屬于真核細胞翻譯起始因子4E（eIF4E）依賴性翻譯的負調(diào)控因子家族，是促使核糖體招募mRNA的因子[17]，4EBP1通過與eIF4E結(jié)合使eIF4E的活性受到抑制，進而抑制蛋白翻譯的起始，4EBP1磷酸化促使兩者分離，失去對eIF4E的抑制作用，進而促進蛋白質(zhì)的翻譯的起始。朱旭明等[18]通過免疫組化法對宮頸癌的研究后發(fā)現(xiàn)，4EBP1在細胞中的染色程度、陽性細胞染色比例隨著宮頸病變程度的加重而升高。在本研究中，4EBP1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中陽性比例顯著增加，結(jié)合以上資料說明4EBP1與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)聯(lián)作用，但如何促進轉(zhuǎn)移，需要進一步研究。

mTOR信號通路相關(guān)信號分子促進惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移主要是通過其磷酸化后的活化形式進行的，p-mTOR就是其主要的活化產(chǎn)物。Guo等[19]報道在上皮性卵巢癌（EOC）中，p-mTOR的蛋白水平明顯高于其它組，同時，p-mTOR的高表達是預測EOC患者預后不良的重要因素。Cao等[20]通過Western blot和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）以及免疫組織化學法檢測胃癌組織中mTOR相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果表明，mTOR蛋白水平的表達雖高于正常胃黏膜但無統(tǒng)計學差異，而p-mTOR在腫瘤組織中的表達比例明顯升高具有統(tǒng)計學意義，mTOR信號通路被激活，主要是通過mTOR磷酸化的增加，而非去磷酸化mTOR的過表達，該學者對胃癌患者的生存期研究后亦發(fā)現(xiàn)，p-mTOR高表達與生存時間較短相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，p-mTOR高表達的患者生存期較短，這與Cao等[20]研究相符。李紅等[21]發(fā)現(xiàn)加入p-mTOR的抑制劑能夠促進CD8+記憶細胞前體細胞的形成，獲得更多年輕化的T細胞，增加機體的免疫功能。

這些資料說明作為mTOR信號通路磷酸化后重要的活性形式，p-mTOR的過度表達在肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用，同樣作為mTOR信號通路下游分子的4EBP1，也與肺鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著重要的關(guān)系。PTEN蛋白的高表達抑制了惡性腫瘤生長的能力，說明PTEN的異常表達可能在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用。而在本研究中mTOR、p-4EBP1、p-p70s6K、p70s6k這4種mTOR信號通路相關(guān)蛋白與肺鱗癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移、患者的生存期無統(tǒng)計學意義，這與一些報道不符，這可能與樣本數(shù)過少有關(guān)，需要加大樣本量。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路與肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性，為探討其在肺鱗癌中的作用提供了臨床數(shù)據(jù)支持，將為肺鱗癌的相關(guān)研究開辟新的途徑以及尋找新的藥物作用靶點提供重要支持。