李 冰， 叢自豪， 肖希勉， 武月銘， 劉潤(rùn)輝

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，超細(xì)材料制備與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200237）

β-半乳糖苷酶（β-Gal）是糖苷水解酶（GH-A）超家族的成員，可以水解半乳糖苷內(nèi)的糖苷鍵以釋放半乳糖[1]。β-Gal 活性降低或缺失會(huì)導(dǎo)致消化乳糖能力下降。研究表明全球約有65%的人遭受乳糖不耐癥的困擾[2]，因此，β-Gal 在乳制品行業(yè)中被廣泛用于制造低乳糖和無乳糖的乳制品[3]。此外，β-Gal 作為熒光探針的酶標(biāo)，用于觀察卵巢癌的轉(zhuǎn)移，在遺傳學(xué)治療領(lǐng)域具有非常重要的意義[4]。蛋白質(zhì)在水溶液中會(huì)受到含水制劑的活性分子對(duì)其化學(xué)以及物理穩(wěn)定性的影響，所以需要將其通過冷凍干燥制成凍干粉，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存和使用。然而，在溫度極低、濃度變化、低壓操作、pH 改變和干燥失水等條件下會(huì)導(dǎo)致蛋白失活和二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，因此在冷凍、干燥和再水化過程中維持β-Gal 的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象穩(wěn)定性和活性仍然受到挑戰(zhàn)，β-Gal 在凍干前需加入蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑以維持其在冷凍干燥過程中的活性。

蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑有氨基酸[5-7]、糖[8-10]、蛋白[11]、鹽[12-13]、聚合物[14-21]等，氨基酸能夠在冷凍狀態(tài)下增加水的表面張力[7]，蔗糖[22-23]、海藻糖[18,24]等糖類可以保留蛋白質(zhì)附近的水分子，其與蛋白質(zhì)形成的氫鍵可以在冷凍干燥過程中穩(wěn)定蛋白質(zhì)。此外，聚合物如聚（乙二醇）[25]、聚（乙烯亞胺）[16]、羥丙基-β-環(huán)糊精[14]可用作添加劑以防止蛋白質(zhì)的聚集和變性。

本文選擇兩種單一手性L-氨基酸進(jìn)行合成，并將其共混聚合物作為蛋白穩(wěn)定劑。這是因?yàn)長(zhǎng)-氨基酸不僅比外消旋氨基酸便宜而且容易降解成人體必需氨基酸；此外，根據(jù)水的替代機(jī)理，聚L-谷氨酸（PLG）能夠與蛋白質(zhì)形成氫鍵并在凍干過程中取代水分子以防止蛋白聚集[5,7,26]；玻璃化轉(zhuǎn)變機(jī)理也表明聚L-賴氨酸（PLL）的非晶結(jié)構(gòu)可以降低蛋白玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[27-28]。通過雙（三甲基硅基）氨基鋰（LiHMDS）引發(fā)的快速氨基酸環(huán)內(nèi)酸酐（NCA）聚合，制備了PLG、PLL氨基酸聚合物，該聚合物具有對(duì)水分不敏感、反應(yīng)速率快的特性，可用于快速篩選合適的蛋白保護(hù)劑[29-30]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

L-谷氨酸-5-叔丁酯：純度98%，阿拉丁試劑（上海）有限公司；Nε-（叔丁氧基羰基）-L-賴氨酸：純度98%，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；三光氣：純度99%，北京伊諾凱科技有限公司；α-蒎烯：純度99%，北京伊諾凱科技有限公司；β-半乳糖苷酶：5 000 U，阿拉丁試劑（上海）有限公司；2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）：純度99%，阿拉丁試劑（上海）有限公司；LiHMDS：純度99%，西格瑪-奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；DMEM 培養(yǎng)液，GE 醫(yī)療生命科學(xué)部；3-（4，5-二 甲 基 噻 唑-2）-2，5-二 苯 基 四 氮 唑 溴 鹽（MTT）：純度98%，上海麥克林生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均購于上海泰坦科技股份有限公司，使用前無進(jìn)一步處理。

1.2 測(cè)試與表征儀器

核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker 公司，AVANCEⅢ 400 MHz 型）：重水（D2O）為溶劑；凝膠滲透色譜：Waters 1515 等強(qiáng)度HPLC 泵；Waters 2414 示差折光檢測(cè)器（RI）；東曹TSKgel Alpha-3000 柱（粒徑為7 μm）；東曹TSKgel Alpha-2500 柱（粒徑為7 μm），柱溫箱溫度為50 °C，檢測(cè)器溫度為35 °C；流動(dòng)相為含10 mmol/L 溴化鋰的二甲基甲酰胺（DMF），流速1 mL/min，標(biāo)準(zhǔn)樣為聚甲基丙烯酸甲酯；酶標(biāo)儀為Molecular Devices SpectraMax M2。

1.3 NCA 單體的合成

1.3.1Nε-（叔丁氧基羰基）-L-賴氨酸-N-羧酸-環(huán)內(nèi)酸酐（Boc-L-Lys NCA）的合成 Boc-L-Lys NCA 合成路線如圖1 所示[31]。在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將Nε-（叔丁氧基羰基）-L-賴氨酸（10.00 g，40.60 mmol）和α-蒎烯（16.98 mL，107.18 mmol）分別加入250 mL 圓底燒瓶中。再加入干燥的四氫呋喃（THF）溶劑使單體懸浮。將三光氣（5.30 g，17.86 mmol）提前溶解在干燥THF 中，冰浴及氮?dú)獗Ｗo(hù)下將其注入上述圓底燒瓶中，使單體濃度為0.3 mol/L。將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)移至50 °C油浴鍋里反應(yīng)并保持2 h，點(diǎn)板監(jiān)控反應(yīng)結(jié)束后撤掉油浴，使用低溫冷凝旋蒸除去多余THF 并立即加入100 mL 乙酸乙酯（EA），轉(zhuǎn)移至500 mL 的分液漏斗中，加入100 mL 冰水萃取1 次，收集有機(jī)相并用100 mL冷的飽和食鹽水洗滌1 次，無水硫酸鎂干燥后過濾，使用干燥的EA 和石油醚（PE）混合溶劑重結(jié)晶3 次（EA 與PE 體積比為4∶5），在充滿氮?dú)獾氖痔紫渲羞^濾得到白色粉末狀晶體5.30 g，產(chǎn)率為48%。1.3.2L-谷氨酸-5-叔丁基-N-羧酸-環(huán)內(nèi)酸酐（tBu-LGlu NCA）的合成tBu-L-Glu NCA 合成路線如圖2所示[32]。在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將L-谷氨酸-5-叔丁酯（5.00 g，24.60 mmol）和α-蒎烯（9.35 mL，59.04 mmol）分別加入250 mL 圓底燒瓶中。再加入干燥的THF 溶劑使單體懸浮。將三光氣（2.92 g，9.84 mmol）提前溶解在干燥的THF 中，冰浴及氮?dú)獗Ｗo(hù)下將其注入上述圓底燒瓶中，使單體濃度為0.3 mol/L。將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)移至50 °C 油浴鍋里反應(yīng)并保持2 h，點(diǎn)板監(jiān)控反應(yīng)結(jié)束后撤掉油浴，使用低溫冷凝旋蒸除去多余THF 并立即加入100 mL EA，轉(zhuǎn)移至500 mL 的分液漏斗中，加入100 mL 冰水萃取1 次，收集有機(jī)相并用100 mL 冷的飽和食鹽水洗滌1 次，無水硫酸鎂干燥后過濾，使用干燥的EA 和PE 混合溶劑重結(jié)晶3 次（EA 與PE 體積比為1∶2），在充滿氮?dú)獾氖痔紫渲羞^濾得到白色粉末狀晶體3.10 g，產(chǎn)率為55%。

圖1 Boc-L-Lys NCA 合成路線Fig.1 Synthetic route of Boc-L-Lys NCA

圖2 tBu-L-Glu NCA 合成路線Fig.2 Synthetic route of tBu-L-Glu NCA

1.4 氨基酸聚合物的合成

1.4.1 聚L-賴氨酸的合成 以Boc-L-Lys NCA 為單體，LiHMDS 為引發(fā)劑，在手套箱里進(jìn)行快速聚L-賴氨酸（PLL）的聚合反應(yīng)，步驟如圖3 所示。稱量Boc-L-Lys NCA（40.8 mg，0.15 mmol）放入干燥的10 mL反應(yīng)瓶中，向瓶中加入0.1 mol/L LiHMDS 的THF 溶液（0.3 mL，0.03 mmol），調(diào)節(jié)單體濃度為0.1 mol/L，薄層層析（TLC）板監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，滴加甲酸淬滅反應(yīng)。用THF-石油醚沉淀體系，重復(fù)溶解-沉淀-離心過程3 次，抽真空干燥后得到了一系列側(cè)鏈帶Boc 保護(hù)的PLL 均聚物。Boc 保護(hù)基團(tuán)用三氟乙酸（CF3COOH）脫除，再采用甲醇-無水乙醚沉淀體系，通過重復(fù)溶解-沉淀-離心過程3 次得到用于提高蛋白穩(wěn)定性的脫保護(hù)的PLL 均聚物。

圖4 聚L-谷氨酸的合成路線Fig.4 Synthetic route of PLG

1.4.2 聚L-谷氨酸的合成 以tBu-L-Glu NCA 為單體，LiHMDS 為引發(fā)劑，在手套箱里進(jìn)行快速聚L-谷氨酸（PLG）的聚合反應(yīng)，步驟如圖4 所示。稱量tBu-L-Glu NCA （103.15 mg，0.45 mmol）放入干燥的10 mL反應(yīng)瓶中，向瓶中加入0.1 mol/L LiHMDS 的THF 溶液（0.45 mL，0.045 mmol），調(diào)節(jié)單體濃度為0.1 mol/L，TLC 板監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，滴加甲酸淬滅反應(yīng)。采用THF-石油醚沉淀體系，重復(fù)溶解-沉淀-離心過程3 次，抽真空干燥后得到了一系列側(cè)鏈帶tBu 保護(hù)的PLG 均聚物。tBu 保護(hù)基團(tuán)用CF3COOH 脫除，再采用甲醇-無水乙醚沉淀體系，通過重復(fù)溶解-沉淀-離心過程3 次得到用于提高蛋白穩(wěn)定性的脫保護(hù)的PLG 均聚物。

1.5 氨基酸聚合物共混后在凍干條件下保護(hù)蛋白效果測(cè)試

1.6 細(xì)胞毒性測(cè)試

1.7 溶血測(cè)試

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的表征

聚合物的GPC 表征結(jié)果如表1 所示。通過GPC 表征的數(shù)均分子量（Mn）可以計(jì)算聚合度（DP）。由表1 可知PLL 的分散性指數(shù)（?）為1.18，分子量分布較為均一，聚合度為19；PLG 的分散性指數(shù)為1.23，聚合度為22。聚合反應(yīng)結(jié)束后，取少量反應(yīng)液在反應(yīng)瓶中并加入對(duì)叔丁基芐胺繼續(xù)反應(yīng)12 h 進(jìn)行封端，用于核磁表征，結(jié)果如圖5 所示。通過苯上的氫確定均聚物的聚合度，PLL 和PLG 經(jīng)對(duì)叔丁基芐胺封端后，由NMR 表征的聚合度分別為18 和23（表1），與GPC 表征的結(jié)果相差不大，符合陰離子活性聚合的基本特征，且所得聚合物結(jié)構(gòu)參數(shù)與單體投料比一致。

表1 PLL 和PLG 在側(cè)鏈被保護(hù)狀態(tài)下的1H-NMR 和GPC 表征結(jié)果Table 1 1H-NMR and GPC characterization results of PLL and PLG at the sidechain protected stage

2.2 氨基酸聚合物在凍干條件下保護(hù)蛋白效果分析

以保存在4°C 未被凍干破壞的新鮮的蛋白活性作為初始活性（100%），分別測(cè)試了PLL 與PLG（質(zhì)量濃度均為1.33 mg/mL）以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)共混后的共混物（以x%PLL+y%PLG 表示，x%，y%分別表示PLL 和PLG 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）在凍干條件下對(duì)蛋白的保護(hù)效果，結(jié)果如圖6 所示。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PLL 與PLG 共混對(duì)蛋白的保護(hù)效果不同，隨著PLG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，保護(hù)效果逐漸增強(qiáng)。未被保護(hù)的β-Gal 蛋白在經(jīng)歷冷凍循環(huán)后活性只剩下38%，20% PLL 與80% PLG 共混后，蛋白活性明顯提升至77%，活性提高了39%，保護(hù)效果非常明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道[5,27-28]，蛋白的凍干包括冷凍和干燥兩個(gè)過程，在冷凍過程中，蛋白的pH 會(huì)發(fā)生改變，此時(shí)氨基酸類聚合物可以與蛋白周圍的水結(jié)合，來維持蛋白的三維構(gòu)象。當(dāng)?shù)鞍妆桓稍飼r(shí)，氨基酸聚合物可以替代水分子，與蛋白表面的殘基相互作用，進(jìn)而維持其結(jié)構(gòu)。蛋白表面有很多帶電荷的殘基，選用帶正電荷的PLL 與帶負(fù)電荷的PLG 以不同質(zhì)量比進(jìn)行共混，也可以平衡蛋白表面的電荷。

2.3 氨基酸聚合物對(duì)顯色劑的影響

采用酶標(biāo)儀對(duì)蛋白與顯色劑結(jié)合后的顯色產(chǎn)物進(jìn)行β-Gal 的活性檢測(cè)。為了排除氨基酸聚合物與顯色劑反應(yīng)對(duì)結(jié)果可能造成的干擾，將聚合物與顯色劑混合，在暗處孵育后，在相應(yīng)的波長(zhǎng)處測(cè)試吸光度值，根據(jù)1.5 節(jié)公式計(jì)算出相應(yīng)的顯色劑活性，結(jié)果如圖7 所示，結(jié)果表明PLL 與PLG 的共混液不與顯色劑ONPG 反應(yīng)，可以確定顯色劑僅僅顯示蛋白的活性。

2.4 氨基酸聚合物的細(xì)胞毒性

PLL 與PLG 共混液對(duì)成纖維細(xì)胞NIH 3T3 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的細(xì)胞毒性如圖8 所示。由圖可知，當(dāng)PLL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于50%時(shí)，共混液中NIH 3T3 和HUVEC 的細(xì)胞存活率都維持在80%以上，隨著PLL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，毒性總體上有所升高，細(xì)胞存活率有所下降，說明在PLL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于50%時(shí)，PLL 與PLG 共混液作為一種蛋白保護(hù)劑可應(yīng)用于對(duì)體內(nèi)蛋白的保護(hù)。

圖5 對(duì)叔丁基芐胺封端的PLL(a)和PLG(b)在脫保護(hù)狀態(tài)下的核磁共振氫譜圖Fig.5 1H-NMR spectra of PLL (a) and PLG (b) on 4-tert-butylbenzylamine terminal functionalization at the deprotected stage

圖6 加入PLL 與PLG 共混液并冷凍循環(huán)后β-Gal 的活性（每個(gè)樣品重復(fù)3 次，**： p ＜ 0.01）Fig.6 Activity of β-Gal added PLL and PLG blending following lyophilization (n=3 for all samples, **: p＜ 0.01)

圖7 PLL 與PLG 共混液對(duì)ONPG 的反應(yīng)活性Fig.7 Reaction activity of PLL and PLG blending for ONPG

2.5 氨基酸聚合物的溶血活性

溶血活性是檢測(cè)蛋白保護(hù)劑生物相容性的指標(biāo)，溶血活性值過高將被限制用于體內(nèi)。PLL 與PLG 共混液對(duì)人血紅細(xì)胞的溶血活性如圖9 所示。當(dāng)PLL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于50%時(shí)，共混液對(duì)人血紅細(xì)胞沒有明顯的溶血活性，當(dāng)PLL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于50%時(shí)，有部分人血紅細(xì)胞被破壞。這個(gè)結(jié)果也與細(xì)胞毒性的測(cè)試結(jié)果相符。說明當(dāng)PLL質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于50%時(shí)，PLL 與PLG 共混液適合作為蛋白的保護(hù)劑。

圖8 PLL 與PLG 共混液對(duì)NIH 3T3 成纖維細(xì)胞（a）和對(duì)HUVEC（b）細(xì)胞毒性的影響Fig.8 Influence of PLL and PLG blending on NIH 3T3 fibroblast cells cytotoxicity (a) and HUVEC cytotoxicity (b)

圖9 PLL 與PLG 共混液對(duì)人血紅細(xì)胞的溶血活性Fig.9 Hemolysis activity of PLL and PLG blending for human red blood cell

3 結(jié) 論

（1）以LiHMDS 為引發(fā)劑，將Boc-L-LysNCA和tBu-L-Glu NCA 兩種單體進(jìn)行開環(huán)聚合，聚合反應(yīng)可在10 min 之內(nèi)完成。

（2）PLL 與PLG 的共混液對(duì)凍干過程中的β-Gal有很好的保護(hù)效果，20%PLL-80% PLG 共混液保護(hù)下凍干后的蛋白活性（77%）與未加保護(hù)劑時(shí)的蛋白活性（38%）相比提高約1 倍。

（3）PLL 與PLG 的共混液對(duì)NIH 3T3 成纖維細(xì)胞和HUVEC 細(xì)胞具有低毒性，對(duì)人血紅細(xì)胞具有低溶血活性，表明其可用作體內(nèi)的蛋白保護(hù)劑。