曹曉曉 徐菁 王海燕 馬巍 李秀維 王建強(qiáng)

摘要：目的：對比分析碘營養(yǎng)適宜和過量對有自身免疫性甲狀腺炎遺傳傾向小鼠甲狀腺轉(zhuǎn)錄組的影響，為碘過量致自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。方法：將18只5周齡NOD·H2h4小鼠隨機(jī)分為對照組和高碘組，分別予適宜碘和過量碘飼養(yǎng)16周。ELISA和HE法進(jìn)行血清甲功和甲狀腺病理檢測。建立甲狀腺轉(zhuǎn)錄組文庫，利用Illumina HiSeq平臺測序，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異和差異基因KEGG通路分析。結(jié)果：適宜碘和過量碘飼養(yǎng)建立了甲狀腺正常和自身免疫性甲狀腺炎小鼠模型，兩組小鼠甲狀腺轉(zhuǎn)錄組存在304個差異表達(dá)基因，其中與細(xì)胞因子、細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞粘附分子通路，以及抗原處理呈遞相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平在高碘組顯著升高。結(jié)論：碘過量可能會過度激活多個與免疫反應(yīng)和炎癥發(fā)生密切相關(guān)的分子通路，共同促進(jìn)自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞：碘過量;轉(zhuǎn)錄組學(xué);自身免疫性甲狀腺疾病;小鼠

國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查顯示，碘缺乏地區(qū)人群在補(bǔ)碘后較長時間內(nèi)AITD患病率和發(fā)病率均會增高[12]，且高水碘地區(qū)的居民中甲狀腺自身抗體陽性伴隨甲狀腺功能減退的患者顯著多于適碘地區(qū)[3]，這些現(xiàn)象能夠在有疾病遺傳易感性的動物模型中得到重復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，90%的NOD·H2h4小鼠在005%NaI水喂養(yǎng)的條件下可被誘發(fā)出實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（EAT）[4]。可見，碘過量是AITD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，特別是對于具有遺傳背景的敏感人群而言，過量碘攝入可能會誘導(dǎo)或加速該類疾病的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者認(rèn)為，碘過量可導(dǎo)致甲狀腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，造成細(xì)胞損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，誘發(fā)甲狀腺免疫功能異常[56]。另外，過量碘攝入還可促使甲狀腺球蛋白（Tg）碘化程度增高，進(jìn)而可能增加其免疫原性[1]。然而，有關(guān)碘攝入過量誘發(fā)AITD的具體分子機(jī)理目前尚不明確。近年來，隨著高通量分析技術(shù)和信息科學(xué)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠在整體水平上研究細(xì)胞特定時空中全部基因轉(zhuǎn)錄本種類、結(jié)構(gòu)和功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的學(xué)科，其相關(guān)技術(shù)為疾病的不同階段、不同結(jié)局的分子機(jī)理和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供了強(qiáng)有力工具[7]。本研究通過適宜碘和過量碘飼養(yǎng)具有自身免疫性甲狀腺炎遺傳傾向的NOD·H2h4小鼠，建立甲狀腺正常和EAT小鼠模型，對比分析兩組甲狀腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)，旨在探索碘過量攝入誘發(fā)自身免疫性甲狀腺炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用的相關(guān)通路，為碘致AITD發(fā)病的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

11儀器與試劑

NaI，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ELISA試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;RNA提取與純化試劑盒、cDNA文庫構(gòu)建試劑盒、PCR反應(yīng)體系，深圳華大基因有限公司;其余試劑，均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AR3130電子天平，中國上海梅特勒托利多公司;5407離心機(jī)，德國Eppendorf公司;EXL 800酶標(biāo)測試儀，美國Biotech公司;AE31顯微鏡，中國廈門麥克奧迪公司;Hiseq 2500測序平臺，Illumina公司。

12實(shí)驗(yàn)動物與分組處理

5周齡雌性NOD·H2H4小鼠（中國醫(yī)科大學(xué)滕衛(wèi)平教授課題組惠贈），在中國疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動物中心SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。按體重將18只小鼠隨機(jī)分成2組：對照組（C）和高碘組（HI），每組9只，分別給予蒸餾水和005%NaI水[4]喂養(yǎng)16周。第16周末處死小鼠，取血清和甲狀腺，將甲狀腺的一葉固定在4%多聚甲醛溶液中，另一葉在液氮中快速冷凍。本實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)中國疾病預(yù)防控制中心動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：NHPF064101）。

13血清指標(biāo)的ELISA檢測

每組隨機(jī)取5只小鼠血清，進(jìn)行甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、促甲狀腺素（TSH）的檢測，采用ELISA檢測試劑盒，具體操作參照說明書。

14甲狀腺組織病理檢測

與13相對應(yīng)，取5只小鼠的一葉甲狀腺進(jìn)行病理檢測。采用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。甲狀腺炎癥程度分級主要依據(jù)甲狀腺濾泡破壞程度和淋巴細(xì)胞浸潤?！?”代表陰性;“+”代表有淋巴細(xì)胞浸潤，濾泡腔內(nèi)充滿膠質(zhì)，濾泡上皮細(xì)胞變扁平;“++”代表有淋巴細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)較多的大濾泡腔，部分有融合破壞;“+++”代表有淋巴細(xì)胞浸潤，50%的濾泡腔壁斷裂、破壞;“++++”代表所有的濾泡腔遭到破壞或者沒有濾泡腔存在。

15轉(zhuǎn)錄組建庫與測序

每組隨機(jī)取9只小鼠的一葉甲狀腺組織，分別稱量，各加入500μL Trizol 裂解液，放入研磨機(jī)中，研磨30s，取出靜置5min，使組織細(xì)胞充分裂解。4℃、12 000 g離心5min。將上清轉(zhuǎn)入加有100μL氯仿/異戊醇（24∶1）的EP管中，顛倒振蕩混勻。4℃、12 000 g離心8min。將上清轉(zhuǎn)入加有200μL異丙醇的離心管中，顛倒混勻置于-20℃冰箱靜置2h以上。4℃、17 500 g離心25min，棄上清，用09 mL 75%乙醇洗滌，上下顛倒懸浮沉淀，4℃、17 500 g 離心3min。棄上清，短暫離心后吸去殘留液體，晾干3～5min。用50μL DEPC水溶解沉淀。Aglient 2100 Bioanalyzer進(jìn)行RNA定量。將每組9葉甲狀腺RNA隨機(jī)分成3個亞組（對照組分為C1、C2、C3;高碘組分為HI1、HI2、HI3），每個亞組取3只小鼠等量的RNA進(jìn)行混勻。然后分別取等量 1μg 亞組RNA樣品，使用oligodT磁珠進(jìn)行純化。將純化的mRNA依次進(jìn)行片段化處理，cDNA合成，末端修復(fù)和接頭連接，PCR反應(yīng)及產(chǎn)物回收，建立最終文庫樣本。按照Illumina Hiseq 2500測序平臺的操作說明制備上機(jī)樣本，進(jìn)行測序;測序結(jié)束后，整理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)和分析。

16測序結(jié)果的分析

共得到6個樣品原始測序結(jié)果，平均產(chǎn)出為550 Gb/樣品。然后過濾去除測序的原始數(shù)據(jù)（raw reads）包含低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的序列。使用HISAT[8]將過濾后的序列（clean reads）與參考基因組序列進(jìn)行比對，分析樣品之間的可比性。然后對組間基因表達(dá)差異性分析和差異基因的京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）的通路注釋分析。

17統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS l30軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)計(jì)量資料用±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn);非正態(tài)計(jì)量資料用中位數(shù)M（p25～p75）表示，組間比較選用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman線性相關(guān);計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=005。

2結(jié)果與分析

21小鼠模型的驗(yàn)證

由表1可見，與C組相比，HI組小鼠血清中TPOAb和TSH水平顯著升高，而血清FT3水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。HI組小鼠表現(xiàn)出自身免疫性甲狀腺炎的血清學(xué)特征。由圖1可見，C組甲狀腺組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，而HI組小鼠甲狀腺組織則出現(xiàn)了濾泡擴(kuò)張和融合，濾泡內(nèi)膠體積聚，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞扁平以及少量淋巴細(xì)胞浸潤。結(jié)合血清學(xué)結(jié)果，本研究通過適宜碘和過量碘飼養(yǎng)NOD·H2h4小鼠分別建立了甲狀腺正常小鼠和EAT小鼠模型。

22小鼠甲狀腺組織轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

針對每個樣本的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，經(jīng)過測序數(shù)量質(zhì)量剪切及統(tǒng)計(jì)，與小鼠參考基因組對比，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組整體質(zhì)量評估。

221測序結(jié)果質(zhì)量分析測序的原始數(shù)據(jù)包含低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的序列。數(shù)據(jù)分析之前需要去除這些序列以保證結(jié)果的可靠性。得到clean reads之后，使用 HISAT[8]將其與參考基因組序列進(jìn)行比對。平均每個樣品的比對率達(dá)到 8699%，同時樣品間均勻的比對率表明樣品之間的數(shù)據(jù)具有可比性（表2）。

222組間差異表達(dá)基因分析圖2結(jié)果顯示，C組和HI組高碘組的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在一定差異性，其中304個基因表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖2A所示，使用散點(diǎn)圖展示差異表達(dá)基因（DEG）的分布。與C組相比，HI組有168個基因的表達(dá)水平降低、125個基因的表達(dá)水平升高。并且對每組 DEG 作表達(dá)量熱圖（圖2B）。

223差異表達(dá)基因的KEGG分析將差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路注釋分析。根據(jù)P值和Q值從大到小進(jìn)行排列（表3）。其中與機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥發(fā)生密切相關(guān)的TNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細(xì)胞粘附分子（CAMs）、細(xì)胞因子受體相互作用和趨化因子信號通路，以及抗原處理及呈遞均在高碘誘發(fā)的EAT小鼠甲狀腺組織中過度激活。

細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等[9]。研究發(fā)現(xiàn)，AITD患者血清中TNF水平顯著升高[10]，且高碘刺激還可誘導(dǎo)AITD患者甲狀腺組織分離細(xì)胞中TNFα的高表達(dá)[11]。同樣，本研究中TNF通路在EAT小鼠甲狀腺中也異?；钴S，其中TNFα誘導(dǎo)蛋白3（Tnfaip3）、TNF 受體超家族1b（Tnfrsf1b）、IL1、IL18等基因呈高表達(dá)狀態(tài)。除了細(xì)胞因子通路，在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中，細(xì)胞趨化因子則參與淋巴組織的發(fā)生與分化過程?，F(xiàn)已證實(shí)，甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞和甲狀腺濾泡細(xì)胞均能產(chǎn)生CC和CXC細(xì)胞趨化因子，它們促進(jìn)了炎癥發(fā)展過程[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，EAT小鼠甲狀腺組織中CXC趨化因子配體10/11/16（Cxcl10/Cxcl11/Cxcl16）基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。其中，Cxcl10和Cxcl11分子水平被證實(shí)在AITD患者血清中顯著升高[1315]。另外，CAMs通路能夠介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合，是免疫應(yīng)答重要的分子基礎(chǔ)。細(xì)胞間粘附分子1（Icam1）能促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的粘附與識別[16]。結(jié)果顯示，Icam1轉(zhuǎn)錄水平在高碘誘發(fā)的EAT小鼠甲狀腺中高于適碘對照組，且CAMs cd40在HI組也是高表達(dá)的。可見碘過量攝入會過度激活甲狀腺內(nèi)多條交錯復(fù)雜的分子通路共同促進(jìn)EAT的發(fā)生發(fā)展。

KEGG分析還發(fā)現(xiàn)，高碘攝入能夠改變甲狀腺組織相容性抗原處理呈遞關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，主要表現(xiàn)為EAT小鼠甲狀腺H2組織相容性抗原中H2Q2、H2Q8、H2Q10、H2T10、H2K2基因的轉(zhuǎn)錄水平的增高。甲狀腺組織相容性抗原發(fā)生變化，可能會引起相容性抗原處理呈遞的紊亂，最終導(dǎo)致甲狀腺受到自身免疫細(xì)胞的攻擊。當(dāng)然，NODH2h4小鼠的H2抗原相關(guān)基因表達(dá)水平的升高與其AITD遺傳傾向性的特征可能有關(guān)，而過量碘攝入則誘發(fā)了這一改變。

3結(jié)論

通過適宜碘和過量碘飼養(yǎng)NOD·H2h4小鼠成功建立了甲狀腺正常小鼠和EAT小鼠模型。經(jīng)對比分析兩組小鼠甲狀腺組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，揭示出碘攝入過量可能會過度激活細(xì)胞因子、細(xì)胞趨化因子、CAMs以及抗原處理呈遞等相關(guān)的分子通路，共同誘發(fā)和促進(jìn)了小鼠甲狀腺炎的發(fā)生發(fā)展。然而，轉(zhuǎn)錄組的這種變化是否會隨著碘干預(yù)時間、濃度和動物模型類型的不同帶來結(jié)果上的差異仍有待于進(jìn)一步的研究。

感謝中國醫(yī)科大學(xué)滕衛(wèi)平教授課題組惠贈NOD·H2h4小鼠?！?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]Luo Y，Kawashima A，Ishido Y，et alIodine excess as an environmental risk factor for autoimmune thyroid disease[J].Int J Mol Sci，2014，15（7）：1289512912

[2]Rayman M PMultiple nutritional factors and thyroid disease，with particular reference to autoimmune thyroid disease[J].Proc Nutr Soc，2019，78（1）：3444

[3]Kwon H，Kim W G，Jeon M J，et alAgespecific reference interval of serum TSH levels is high in adolescence in aniodine excess area：Korea national health and nutrition examination survey data[J].Endocrine，2017，57（3）：445454

[4]國秀娟碘過量對碘缺乏NODH2h4小鼠甲狀腺形態(tài)、功能和自身免疫機(jī)制影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2007

[5]高天舒，李靜，滕衛(wèi)平中、輕度碘過量對大鼠甲狀腺濾泡上皮凋亡及Fas/FasL表達(dá)的影響[J].中國地方病學(xué)雜志，2005，24（3）：267270

[6]譚雪，徐菁，馬巍，等Bcl2家族參與碘誘發(fā)自身免疫性甲狀腺炎小鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡[J].衛(wèi)生研究，2019，48（2）：273278

[7]劉偉，郭光艷，秘彩莉轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要研究技術(shù)及其應(yīng)用概述[J].生物學(xué)教學(xué)，2019，44（10）：25

[8]Kim D，Langmead B，Salzberg S LHISAT：a fast spliced aligner with low memory requirements[J].Nat Methods，2015，12（4）：357360

[9]李群芳，武蕾，姜寧鵬細(xì)胞因子的研究概況[J].山東畜牧獸醫(yī)，2019，40（11）：6769

[10]Gu L Q，Zhu W，Pan C M，et alTumor necrosis factor alpha （TNFalpha）polymorphisms in Chinese patients with Graves disease[J].Clin Biochem，2010，43（3）：223227

[11]劉超，段宇，蔣須勤，等碘化鈉對人甲狀腺細(xì)胞IL6、IFNγ和TNFα基因表達(dá)的影響[J].上海免疫學(xué)雜志，2001，21（1）：1820

[12]于秀杰，李慶欣，劉澤兵，等細(xì)胞趨化因子CCL21及CC趨化因子受體7在過量碘和甲狀腺球蛋白免疫誘發(fā)的NOD小鼠甲狀腺炎中的表達(dá)[J].中華地方病學(xué)雜志，2015，34（4）：260264

[13]俞靈鶯，馬麗珍細(xì)胞因子與橋本甲狀腺炎及其相關(guān)防治進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（3）：379383

[14]胡天一，劉戈力趨化因子CXCL10及其受體CXCR3與Graves病[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，16（4）：693696

[15]趙冬靜初發(fā)Graves病患者～（131）I治療前后血清CXCL10、CCL22水平變化及相關(guān)研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2012

[16]張志友，方佩華細(xì)胞間粘附分子1與自身免疫性甲狀腺疾病[J].國外醫(yī)學(xué)（內(nèi)分泌學(xué)分冊），2000，20（4）：175178