王華 劉冬靈 金其揚 蒙麗瓊

摘 要：目的：評定高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法檢測禽蛋中恩諾沙星殘留量的不確定度及擴展不確定度。結(jié)果：當(dāng)禽蛋中恩諾沙星含量為6.63μg/kg時，在95%的置信區(qū)間下，擴展不確定度為1.2μg/kg（k=2）。結(jié)論：實驗過程的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定度，其次為重復(fù)測量和回收率的不確定度。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法;禽蛋;恩諾沙星;不確定度

恩諾沙星是第三代喹諾酮藥物的一種，是合成抗菌藥物，其毒性主要取決于藥劑量和動物種類[1-2]。研究證明恩諾沙星在實驗動物中顯示一定的致突變和胚胎毒性作用[3]。喹諾酮類藥物廣泛用于獸醫(yī)臨床，已經(jīng)出現(xiàn)了細菌耐藥性，并且在動物源性食品中的喹諾酮殘留量容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性[4-5]。我國、歐盟、美國、日本等都制定了喹諾酮在各動物組織中最大允許殘留限量[6-9]。美國FDA于2005年禁止恩諾沙星作為飼料添加劑用于禽類[10]。我國規(guī)定家禽產(chǎn)蛋期禁用恩諾沙星[11]。禽蛋中恩諾沙星的檢測方法有液相色譜法、液質(zhì)法、酶聯(lián)免疫吸附法[12-15]。測量不確定度表征賦予了被值的分散性，是測量結(jié)果的一部分，是符合性判斷需要考慮的主要內(nèi)容之一[16-17]。禽蛋中恩諾沙星的不確定度評定具有非常重要的意義，目前鮮少有報道禽蛋中恩諾沙星殘留量的測定的不確定度評定。本文基于GB/T 21312-2007進行禽蛋中恩諾沙星殘留量檢測的不確定度評定。

1 材料和方法

1.1 試劑與耗材

正己烷、乙睛、甲酸（AR），甲酸、甲醇（色譜純），14種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)溶液（ANPEL）。

1.2 儀器和設(shè)備

安捷倫6410B列安捷倫液相--質(zhì)譜色譜儀（ESI源）;分析天平：十萬分之一天平（賽多利斯ecura225D-1CN），檢定允許誤差為±0.0001g;電子天平：JJ1000/0.01g～1000g，允差±0.05g;旋渦混合器;離心機;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

按照稱取2.00g禽蛋試樣按照GB/T 21311-2007進行樣品處理，用2.00mL甲酸--乙睛溶液定容。

1.3.2 色譜條件

XDB-C18色譜柱（4.6×50mm，1.8μm）;柱溫35℃;進樣量2μL;流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水;流動相洗脫程序：0-1min，80%B;1-7min，80%B線性變至50%B;7-8min，50%B-80%。

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源：ESI（+）;掃描模式：MRM;干燥氣：350℃，45psi，10L/min;毛細管電壓：4000V。定量離子對360/342.2，定性離子對360/316.2。

2 結(jié)果和分析

2.1 不確定度的來源分析

根據(jù)分析步驟，不確定度的主要來源主要有：①樣品質(zhì)量稱量（m）;②定容體積（V）;③被測物質(zhì)量濃度（C）;④測量重復(fù)性;⑤回收率。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 樣品稱量的不確定度u（m）

稱取2g樣品，所用天平最大允許誤差為±0.01g，按照矩形分布計算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

2.2.2 定容體積產(chǎn)生的不確定度u（v）

樣品最后用2mL分度吸量管取V為2mL水溶解蒸殘物。

2.2.3 被測物的質(zhì)量濃度產(chǎn)生的不確定度u（C）

C的不確定度來源有標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。其中標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制又分為儲備液的稀釋、標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制。

2.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋產(chǎn)生的不確定度u（C-1）

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)證書，恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品的純度誤差為±5%，按照均勻分布計算，由純度引入的不確定度和相對不確定度分別為：

用1mL單標(biāo)線吸量管移取儲備液1mL于10mL容量瓶（A級）中，用乙腈定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（1：10稀釋）。按照均勻分布處理，玻璃器具及溫度波動引入的不確定度見表1。

2.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程產(chǎn)生的不確定度u（C-2）

使用20、100、200μL移液器分別移取一定的標(biāo)準(zhǔn)溶液于1mL容量瓶中，用空白禽蛋基質(zhì)溶液定容至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，移液器的刻度誤差參考JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》的要求，按A類評定，如表2所示。

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度u（C-3）

將空白禽蛋基質(zhì)溶液配制的5種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，各取5μL分別重復(fù)進樣3次，以峰面積（Ai）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（Ci）為橫坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合而成的線性回歸方程為Ai=aCi+b，測定數(shù)據(jù)及計算結(jié)果如表3。取一陽性樣品，對各待測化合物濃度C0進行3次重復(fù)測定，平均結(jié)果為14.7μg/L，則由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度按（1）式計算：

式中：SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液待測物峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差;a為斜率;b為截距;p為對樣品溶液C0的測定次數(shù)，p=3;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測試次數(shù)，本實驗中5個質(zhì)量濃度重復(fù)測定3次，n=5×3=15;Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點的待測物的峰面積;Ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點的待測物的質(zhì)量濃度;C0為校準(zhǔn)方程求得的陽性樣品溶液中待測物的質(zhì)量濃度;為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均質(zhì)量濃度，;則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（C-4）=u（C4）/C0，結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

實驗過程中，稱量、提取、凈化測定等過程均會引入不確定度，本實驗通過對質(zhì)量、體積、實驗室溫度、玻璃儀器、溶液配制、稀釋、重復(fù)測定、回收率等因素研究，通過計算，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定度最大，其次為回收率、測量重復(fù)性和體積量取引入的不確定度影響。因此，在實驗過程中，認(rèn)真配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，增加平行樣品測定，提高實驗人員檢測的精密性和準(zhǔn)確度水平，可達到減小測量不確定度，從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻：

[1]岳振峰，中國檢驗檢疫科學(xué)研究院.食品中獸藥殘留檢測指南[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[2]龐國芳.獸藥多組分殘留分析技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2016.

[3] Hopper D C，Wolfson J S.Mode of action of the new quinolones：New data. European Journal of Clinical Microbiology，1991，10（4）：223-231.

[4] Kato et al.New Topoisomerase Essential For Chromosome Segregation in E. coli. Cell 63，393-404.Harold C. Neu.The Crisis in Antibiotic Resistance.Science ?1992，257（5073）：1064-1073.

[5]Yoshida H ，Kojima T，Yamagishi J.Quinolone-resistant mutations of the gyrA gene of Escherichia coli.Molecular and General Genetics MGG.，1988，211（1）：1-7.

[6]European Commission， Regulation 99/508/EEC of 9th March 1999.Official Journal of European Communities，1999，L60：305.

[7]農(nóng)業(yè)部公告第235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2002.

[8] Federal Register.May 22，1997，62：27944-27947.

[9]《食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量》編委會.食品卷：食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量：日本肯定列表制度[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[10]FDA：FDA Announces Final Decision About Veterinary Medicine.FDA News， July ，28，2005.

[11] GB 31650-2019.食品中獸藥殘留最大殘留限量[S].北京：國家市場監(jiān)督管理總局，2019.

[12]農(nóng)業(yè)部781號公告-6-2006.雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法[Z].

[13] GB/T 21312-2007.動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].北京：國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2007.

[14]農(nóng)業(yè)部1025號公告-25-2008.動物源食品中恩諾沙星殘留檢測 酶聯(lián)免疫吸附法[Z].

[15]農(nóng)業(yè)部1025號公告-8-2008.動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測 酶聯(lián)免疫吸附法[Z].

[16] RB/T141-2018.化學(xué)檢測領(lǐng)域測量不確定度評定 利用質(zhì)量控制和方法確認(rèn)數(shù)據(jù)評定不確定度[S].北京：中國國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會，2018.

[17] CNAS-TRL-010-2019 CNAS-TRL-010-2019.測量不確定度在符合性判定中的應(yīng)用[Z].

通訊作者：

蒙麗瓊，高級工程師，主要研究方向為食品質(zhì)量安全。

基金項目：“十三五”北海市海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展示范項目（Bhsfs009）