楊 蘭， 李 欠， 馮彥梅， 邱黛玉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中草藥栽培與鑒定系，甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

中藥白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahuricae(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.]或杭白芷[A.dahuricae(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)ShanetYuan]的干燥根[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并列為中品，因干燥初生根為芷，色白，故名白芷，在中國(guó)有著悠久的藥食兩用的歷史[2]。白芷性溫，氣芳香，味辛，微苦，具有解表散寒、通竅止痛、祛風(fēng)除濕、消腫排膿、抗炎、解熱、美白等作用，在臨床實(shí)踐中，廣泛應(yīng)用于風(fēng)寒感冒、頭痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、赤白帶下、癰疽瘡瘍、濕盛久瀉等病癥，特別是用于風(fēng)寒侵犯陽(yáng)陰引起的頭痛，其療效較顯著[3-8]。除作藥用外，在食品、保健品、香料、護(hù)膚美容、日用化工等方面也有廣泛的應(yīng)用[9]，特別是其干燥根作為調(diào)味料可增香添味，脫臭除異，增進(jìn)食欲[10]。

白芷中主要的生物活性成分有香豆素、揮發(fā)油、多糖和微量元素[11]。香豆素主要包括歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、水合氧化前胡素和異珊瑚菜素[12]。在2015版藥典中常用歐前胡素含量對(duì)白芷進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[13]。目前，歐前胡素的測(cè)定多采用高效液相色譜法，該法存在耗時(shí)(出峰時(shí)間為11.6 min)、樣品預(yù)處理復(fù)雜、標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。因此，建立一種快速、可靠的測(cè)定白芷中歐前胡素含量的方法具有一定的現(xiàn)實(shí)意義[14-18]。近年來，1H核磁共振波譜法(1H qNMR)已被廣泛成功地應(yīng)用于化學(xué)藥品、中藥及植物提取物、液體樣品、異構(gòu)體、食品等的定量分析[19-20]。該法具有檢測(cè)時(shí)間短、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、儀器操作相對(duì)簡(jiǎn)單、特異性好以及分析過程中不需要昂貴的對(duì)照品等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是特征峰的峰面積與質(zhì)子數(shù)成正比，常用絕對(duì)內(nèi)標(biāo)定量法，即以待測(cè)物與已知內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值確定待測(cè)物的含量[21-26]。

本研究采用氫核磁共振建立白芷中歐前胡素含量測(cè)定新方法，并對(duì)白芷樣品進(jìn)行分析，并用高效液相色譜法(HPLC)驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核磁共振儀(400 MHz，MestReNova數(shù)據(jù)處理軟件，Bruker公司產(chǎn)品)；超聲清洗器，深圳市得康科技有限公司產(chǎn)品；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇正基儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，慈溪市天東衡器廠產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；JFSD-100粉碎機(jī)，上海嘉定糧油儀器有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀，島津公司產(chǎn)品。

歐前胡素，上海源業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品，≥98%；對(duì)苯二酚，上海麥克林生化有限公司產(chǎn)品，≥99%；氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室有限公司產(chǎn)品，≥99.9%；甲醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，≥99.5%。

白芷購(gòu)于四川省遂寧市的新橋、大英、新勝等地。

1.2 測(cè)試條件

采用zg30脈沖序列，測(cè)定溫度為293.7 K，譜寬(SWH)為8 012.8 Hz，采樣時(shí)間(AQ)為4.0 s，弛豫時(shí)間(D1)為1 s，脈沖寬度(P1)14.90 s，樣品掃描次數(shù)(NS)32次，空掃次數(shù)(DS)為2次。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

1.3 溶液制備

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取30 mg內(nèi)標(biāo)物對(duì)苯二酚溶解至6.0 ml DMSO中，制得內(nèi)標(biāo)溶液，作為核磁共振波譜法(qNMR)定量的內(nèi)標(biāo)樣品。供試品溶液制備：采用劉紅梅等[27]的方法進(jìn)行制備。取白芷粉末(過40目篩)約25 g，精密稱量，置于容量瓶中，精密加入甲醇125 ml，超聲波處理(40 min，40 ℃)，靜置冷卻，取上清液，重復(fù)2次。將2次提取液合并，過濾，濾液水浴加熱得粗浸膏，稱量粗浸膏質(zhì)量。取粗浸膏0.06 g，精密稱量，加0.5 ml內(nèi)標(biāo)溶液，超聲波溶解，移置核磁管，用于氫核磁共振法測(cè)定。取上述粗浸膏0.06 g，精密稱量，加入3 ml甲醇，超聲波溶解，過微孔濾膜(0.45 μm)，移置進(jìn)樣小瓶，用于高效液相色譜法測(cè)定。核磁共振標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取3 mg歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品，溶解至0.5 ml內(nèi)標(biāo)溶液中，制得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑、內(nèi)標(biāo)與定量峰的選擇

測(cè)定結(jié)果表明，歐前胡素及對(duì)苯二酚在DMSO-d6中均有較好的溶解性，且譜峰不重疊，因而選用DMSO-d6作為溶劑，對(duì)苯二酚作為內(nèi)標(biāo)。以歐前胡素中δ7.65峰為定量峰，對(duì)苯二酚中δ6.55峰為內(nèi)標(biāo)定量峰(圖1)。

2.2 定量核磁共振波譜法的方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系 分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g，并各加入0.5 ml內(nèi)標(biāo)溶液，制備6個(gè)不同濃度的樣品溶液，測(cè)定1H NMR波譜。分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物特征信號(hào)峰的峰面積進(jìn)行積分，每個(gè)樣品的積分面積取3次積分的平均值。以標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物的積分面積比值(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比值(x)進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程(圖2)。圖2表明標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比值在1.2至3.2范圍內(nèi)與兩者定量峰面積比值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 歐前胡素(A)、對(duì)苯二酚(B)和兩者的混合物(C)的1H qNMR波譜Fig.1 1H quantitative nuclear magnetic resonance(qNMR) spectra of imperatorin (A), hydroquinone (B) and their mixture (C)

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比、面積比的線性關(guān)系Fig.2 The linear relationship of mass ratio and area ratio between standard and internal standard

2.2.2 精密度 取制備的核磁共振波譜法標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在核磁共振測(cè)試條件下，重復(fù)測(cè)定5次。以標(biāo)準(zhǔn)品定量峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量峰面積的比值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，RSD=0.654%。

2.2.3 穩(wěn)定性 取用于氫核磁共振波譜法測(cè)定的溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定。以樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)物定量峰面積比值計(jì)算RSD，RSD=1.339%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性 在核磁共振波譜法測(cè)定溶液制備條件下，平行制備6份供試品溶液，在同一試驗(yàn)條件下測(cè)定。以樣品定量峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量峰面積的比值計(jì)算RSD，RSD=1.837%，表明重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率 取同一批已知含量的樣品浸膏約0.03 g，精密稱量，平行6份，分別精密加入0.5 ml歐前胡素對(duì)照品溶液，超聲波溶解，移至核磁管，在核磁共振測(cè)試條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 1H核磁共振波譜法(1H qNMR)測(cè)定白芷中歐前胡素的回收率

2.3 樣品中歐前胡素含量測(cè)定及HPLC驗(yàn)證

取制備樣品0.06 g，精密稱量，制備供試品溶液，進(jìn)行核磁共振波譜法測(cè)定(表2、圖3)。計(jì)算樣品中歐前胡素含量(W1)，W1=A1W2M1n2/A2M2n1，式中W1、W2分別為目標(biāo)物、內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，A1、A2分別為目標(biāo)物、內(nèi)標(biāo)物的積分面積，M1、M2分別為目標(biāo)物、內(nèi)標(biāo)物的分子量，n1、n2分別為目標(biāo)物、內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)子數(shù)。由表2可知，產(chǎn)自新橋、大英和新勝的白芷中歐前胡素含量分別為0.204%、0.200%和0.220%。另外，采用高效液相色譜法對(duì)白芷樣品中歐前胡素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明兩種方法所得結(jié)果無顯著差異(表2、圖4)。

表2 1H核磁共振波譜法(1H qNMR)和高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定白芷中歐前胡素含量

圖3 新橋(A)、新勝(B)、大英(C)白芷提取物的1H核磁共振波譜圖Fig.3 1H qNMR spectra of Angelica dahuricae extracts from Xinqiao(A), Xinsheng(B) and Daying(C)

圖4 新橋、新勝、大英白芷提取物的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of Angelica dahuricae extracts from Xinqiao(A), Xinsheng(B) and Daying(C)

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了定量核磁共振波譜法測(cè)定白芷中歐前胡素含量的方法。該法具有檢測(cè)時(shí)間短、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、儀器操作相對(duì)簡(jiǎn)單、特異性好、分析過程中不需要昂貴的對(duì)照品等優(yōu)點(diǎn)，且測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法基本一致。采用1H qNMR法測(cè)定了白芷中歐前胡素含量，并用HPLC法驗(yàn)證。結(jié)果表明，1H qNMR法和HPLC法的定量測(cè)定結(jié)果基本一致。1H qNMR法可用于白芷中歐前胡素含量的測(cè)定，為白芷質(zhì)量控制提供了一種快速、有效的新方法。