徐 龍， 曹小安， 劉永生， 周建華， 張廣林， 孫晶晶， 李玲霞， 趙永婕，胡永浩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)感染引起的人畜共患傳染病，具有流行廣泛、危害極大的特點(diǎn)。近年來，布魯氏菌給中國的公共衛(wèi)生與安全帶來了新挑戰(zhàn)。由于布魯氏菌沒有明顯的外毒素，其依靠外膜蛋白、脂多糖及Ⅳ型分泌系統(tǒng)發(fā)揮毒力并通過抑制溶酶體的相關(guān)功能抵抗細(xì)胞凋亡和逃離細(xì)胞死亡與降解。Brucella在宿主發(fā)揮細(xì)胞免疫和體液免疫時(shí)，具有逃避能力。Brucella在侵入機(jī)體后，主要侵染胚胎細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，胞內(nèi)生存和繁殖是其主要致病機(jī)理，其免疫機(jī)制在逃離宿主的免疫系統(tǒng)時(shí)發(fā)揮了重要作用[1]。

諸如OMP10、OMP19和BP26等外膜蛋白刺激BM-DCs(小鼠分離髓源樹突狀細(xì)胞)后，BM-DCs表面共刺激分子和MHC分子的表達(dá)及培養(yǎng)上清液中IL-12、IL-10、INF-γ、TNF-α的分泌均顯著增加。而OMP25和OMP31刺激BM-DCs后會(huì)顯著抑制部分表面分子的表達(dá)及炎性細(xì)胞因子IL-12、IL-6、INF-γ、TNF-α的分泌[2]。Dohmer等[3]也發(fā)現(xiàn)了其他種類的分泌蛋白質(zhì)，但對這些蛋白質(zhì)的功能仍處于探索階段，具體機(jī)制也尚未研究透徹。劉景福等[4]發(fā)現(xiàn)BP26蛋白在BP26免疫模型上能夠形成明顯的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。王勇等[5]發(fā)現(xiàn)重組蛋白BP26作為檢測抗原建立的間接ELISA方法效果較為理想，可適用于臨床布魯氏菌感染的檢測。王芳等[6]發(fā)現(xiàn)基于BP26建立的間接ELISA檢測方法在檢測Brucella時(shí)不能對細(xì)菌種屬及其來源進(jìn)行有效區(qū)分，通過檢測BP26抗體不能對羊布魯氏菌病進(jìn)行有效區(qū)分和診斷。對小鼠接種OMP或L7/L12抗原的DNA疫苗或重組蛋白質(zhì)可有效對抗布魯氏菌有毒株的攻擊感染。Saadi等[7]從OMP31、BP26、BLS、DnaK和L7/L12蛋白中篩選了5個(gè)新的T細(xì)胞表位，并基于上述蛋白質(zhì)制成多表位肽疫苗使其穩(wěn)定有效表達(dá)，在未來有可能用于預(yù)防或治療布魯氏菌病。

雖然BP26能夠產(chǎn)生強(qiáng)力的抗體，但有效的抗原在細(xì)菌侵染宿主細(xì)胞時(shí)發(fā)揮的作用和分子機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)選取布魯氏菌外膜蛋白基因BP26進(jìn)行全基因擴(kuò)增，并成功將其構(gòu)建到pET-30a質(zhì)粒中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，獲得了重組質(zhì)粒pET-30a-BP26。說明該蛋白質(zhì)可在大腸桿菌內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。利用分子生物學(xué)的方法對BP26蛋白進(jìn)行分析，獲得了BP26蛋白的相關(guān)特性的基本信息，為未來研究布魯氏菌侵襲宿主后BP26蛋白會(huì)通過何種信號通路對機(jī)體產(chǎn)生影響及相關(guān)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 布魯氏菌陽性基因組、質(zhì)粒pET-30a(+)為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存。大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 血清與抗體 羊布魯氏菌陽性血清為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.3 主要生化試劑 2×EasyTaq? PCR SuperMix (+dye )、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA Ligase、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、IPTG購自寶生物工程(大連)有限公司,卡那霉素、30% Acr制膠液、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、PBS(pH=7.2)購自北京索萊寶科技有限公司，High Affinity Ni-Charged Resin FF購自南京金斯瑞生物科技有限公司，Tryptone、Yeast Extract購自O(shè)XOID公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物、病毒及試劑 28～42日齡BALB/C小鼠由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物中心提供，所有動(dòng)物試驗(yàn)按照單位相關(guān)倫理要求進(jìn)行。

胎牛血清購自美國Glbco公司。重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組小鼠白介素-4(rmIL-4)購自美國PeproTch公司。單克隆抗體為兔抗鼠的PE-CDllC、FITC-MHCⅡ、FITC-CD86、APC-CD80、APC-CD40，均購自美國BD Biosciences公司。陽性對照為布魯氏菌脂多糖(LPS)，購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 使用Primer Premier5.0篩選出最優(yōu)引物，上下游引物兩端添加保護(hù)性堿基并分別引入EcoR Ⅰ和SalⅠ 2個(gè)酶切位點(diǎn)，并對密碼子進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，引物：BP26-F:5′-CCGGAATTCGCCACCATGCAGGAGAATCAGATGACG-3′,BP26-R:5′-CCGGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGCTTGATTTCAAAAACGAC-3′),酶切位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出。設(shè)計(jì)完成的引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增片段長度為666 bp。

1.2.2 布魯氏菌BP26基因的PCR擴(kuò)增及克隆 以布魯氏菌基因組作DNA模板，擴(kuò)增體系參照說明書進(jìn)行配置。采用2×EasyTaq?PCR SuperMix(+dye)和合成的引物在56 ℃退火溫度下擴(kuò)增獲得BP26目的片段，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物在1.15%瓊脂糖凝膠上電泳，參照膠回收試劑盒說明書對切取的目的條帶進(jìn)行回收。用EcoRⅠ和SalⅠ對回收后的目的片段與pET-30a載體質(zhì)粒在37 ℃水浴鍋中雙酶切4～5 h后回收。 用T4連接酶體系16 ℃過夜連接線性化酶切的質(zhì)粒和目的基因產(chǎn)物。將全部連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α中，冰浴30 min后42 ℃ 熱激90 s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上放置3 min。在含200 mg/L的Kan+抗性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，37 ℃ 倒置過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆的菌落小搖后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及酶切鑒定。將鑒定成功的質(zhì)粒送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 布魯氏菌BP26重組蛋白的表達(dá)及純化 將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21中保存，挑取單個(gè)陽性克隆的菌落接種至5 ml含Kan抗性液體LB中37 ℃過夜培養(yǎng)。吸取2 ml培養(yǎng)的菌液至200 ml含Kan抗性液體LB中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，設(shè)置誘導(dǎo)溫度為16 ℃、25 ℃、37 ℃ 3個(gè)梯度，設(shè)置IPTG的終濃度分別為1.00×10-3mol/L、5.00×10-4mol/L、2.50×10-4mol/L、1.25×10-4mol/L、1.00×10-4mmol/L 5個(gè)梯度，設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間為3 h、4 h、5 h、6 h 4個(gè)梯度。各設(shè)置條件誘導(dǎo)結(jié)束后收獲菌液，8 000 r/min，4 ℃，離心30 min，棄上清液，用少許0.01 mol/L的PBS再次懸浮沉淀后用同等條件離心，收集沉淀。用Lysis equilibration buffer (LE Buffer)對沉淀進(jìn)行懸浮后，超聲破碎儀裂解，超聲5 s，間歇2 s，工作時(shí)間為1 h。破碎結(jié)束后以上述同等條件離心分離上清液和沉淀，分別取上清液與沉淀40 μl和10 μl， 5×SDS-PAGE Loading Buffer充分混勻煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE，完成后使用考馬斯亮藍(lán)染色液對蛋白質(zhì)膠室溫染色4 h后，再以脫色液充分脫色，分析重組蛋白質(zhì)BP26的表達(dá)水平。

將成功鑒定的布魯氏菌BP26蛋白表達(dá)液裝入經(jīng)LE Buffer平衡后的His-Tag Ni柱中，收集流穿液后以LE Buffer洗脫4個(gè)柱體積后，以含20 mmol/L濃度咪唑LE Buffer為起點(diǎn)對柱內(nèi)的沉淀進(jìn)行洗脫，柱底端口液體流速控制在1.0～1.5 ml/min。含20 mmol/L濃度咪唑LE Buffer洗滌5個(gè)柱體積， 含40 mmol/L濃度咪唑LE Buffer洗滌3個(gè)柱體積，含60 mmol/L濃度咪唑LE Buffer、含160 mmol/L濃度咪唑LE Buffer各洗滌1個(gè)柱體積，含250 mmol/L濃度咪唑LE Buffer洗脫2個(gè)柱體積，含20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、160 mmol/L濃度咪唑LE Buffer流出液各收集2 ml，含250 mmol/L濃度咪唑LE Buffer流出液全部收集，純化獲得試驗(yàn)所需的目的蛋白質(zhì)。

1.2.4 布魯氏菌BP26重組蛋白的Western-Blot分析 參考文獻(xiàn)[8]中的方法，將稀釋液調(diào)整為10倍稀釋的Casein封閉液，優(yōu)化一抗孵育時(shí)間為1 h，二抗孵育時(shí)間為45 min，對BP26蛋白進(jìn)行Western-Blot分析。

1.2.5 小鼠髓源樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng) 選取4只SPF級的42～56日齡BALB/c雌性小鼠，參照文獻(xiàn)[9]分離小鼠髓源樹突狀細(xì)胞(BM-DCs)。參考文獻(xiàn)[10]中的方法用rmGM-CSF和rmIL-4刺激，使分離制備的骨髓原代細(xì)胞分化為未成熟DCs。DCs培養(yǎng)至第6 d，調(diào)整BP26蛋白終濃度為100 μg/ml刺激DCs細(xì)胞；調(diào)整LPS 終濃度為100 ng/ml刺激DCs細(xì)胞，并將該組選作陽性對照，開展后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6 布魯氏菌BP26蛋白刺激鼠源樹突狀細(xì)胞 設(shè)置LPS與重組 BP26蛋白分別刺激BM-DCs 24 h后，收集DCs，1 500 r/min離心7 min，收集上清液進(jìn)行與介導(dǎo)細(xì)胞炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的檢測。BM-DCs沉淀用含有5%胎牛血清、pH為7.2的PBS懸浮，對DCs活性以PE-CDllC抗體4 ℃ 避光染色30 min后經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。DCs共刺激分子表達(dá)分析： 設(shè)置PE-CD11C、APC-CD40、FITC-MHCⅡ三色共染為試驗(yàn)組一，設(shè)置PE-CD11C、APC-CD80、FITC-CD86為試驗(yàn)組二。同時(shí)設(shè)置同型對照和單染管，抗體4 ℃染色30 min，加入1 ml含有5%胎牛血清的PBS，1 500 r/min，7 min離心收集DCs。上述PBS重懸細(xì)胞，用FAC SC alibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子檢測 將BM-DCs沉淀以Trzol法提取細(xì)胞RNA并測定其濃度，使用Qiagen Omniscript RT Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用2×SYBR Green Abstart PCR Mix，以cDNA為模板，參考文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)需要檢測的細(xì)胞因子引物，各體系與擴(kuò)增條件參照說明書。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)獨(dú)立重復(fù)，擴(kuò)增結(jié)束后記錄Ct值 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析

采用FlowJo V10軟件對經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測獲得的結(jié)果進(jìn)行分析，采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad Prism 8進(jìn)行繪圖，采用SPSS V25.0軟件對試驗(yàn)組和對照組的流式數(shù)據(jù)與Ct值進(jìn)行差異顯著性分析，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

基于挑取的陽性克隆菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以挑取的菌落培養(yǎng)的菌液作為DNA模板再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2次均擴(kuò)增出666 bp大小的條帶。參照質(zhì)粒小提試劑盒使用說明書提取菌液質(zhì)粒，并用EcoRⅠ和SalⅠ將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-BP26雙酶切后瓊脂糖電泳，分別得到大小正確的目的片段和載體片段(圖1)。

M：2 000 DNA marker ；1：質(zhì)粒pET-30a-BP26酶切產(chǎn)物。圖1 表達(dá)載體雙酶切圖譜Fig.1 Restriction enzyme map of expression vector

2.2 BP26蛋白的重組表達(dá)

對純化后的BP26蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后經(jīng)卡馬斯亮藍(lán)染色后脫色，最佳誘導(dǎo)條件為：溫度37 ℃，IPTG濃度5×10-4mol/L，時(shí)間5 h時(shí)。誘導(dǎo)后可在30 000左右出現(xiàn)條帶(圖2)，與預(yù)期條帶大小最符合，條帶最為清晰，證明該條件下BP26蛋白在BL21(DE3)中的表達(dá)量最高。

M：蛋白質(zhì)marker;1：pET-30a-BP26上清液;2：pET-30a-BP26沉淀。圖2 SDS-PAGE鑒定pET-30a-BP26表達(dá)結(jié)果Fig.2 Expression of pET-30a-BP26 by SDS-PAGE

將純化誘導(dǎo)表達(dá)上清液中的BP26蛋白的各濃度咪唑洗脫液經(jīng)SDS-PAGE鑒定分析，發(fā)現(xiàn)在泳道1有BP26蛋白和大量雜蛋白質(zhì)出現(xiàn)，證明誘導(dǎo)表達(dá)上清中的蛋白質(zhì)并未完全與High Affinity Ni-Charged Resin FF結(jié)合；泳道2出現(xiàn)了與泳道1相同的情況，證明LE Buffer據(jù)有將蛋白質(zhì)從高親和力樹脂上洗脫下來的能力，泳道3～6并未出現(xiàn)明顯的蛋白質(zhì)條帶，但是從泳道7、泳道8可以觀察出BP26蛋白的表達(dá)量較多，而雜蛋白質(zhì)條帶幾乎沒有。說明20～160 mmol/L濃度咪唑洗脫液可以充分將雜蛋白質(zhì)從親和樹脂上洗脫下來，洗脫效果最佳的咪唑濃度為40 mmol/L(圖3)。

M：蛋白質(zhì)marker；1：BP26流穿液；2：LE Buffer洗滌后結(jié)果；3：含20 mmol/L 咪唑LE Buffer洗滌結(jié)果；4：含40 mmol/L 咪唑LE Buffer洗滌結(jié)果 5：含60 mmol/L咪唑LE Buffer洗滌結(jié)果；6：含160 mmol/L咪唑LE Buffer洗滌結(jié)果 ；7、8：含250 mmol/L咪唑LE Buffer洗脫結(jié)果。圖3 BP26蛋白純化電泳檢測Fig.3 Electrophoresis detection of BP26 protein

2.3 BP26蛋白Western blotting檢測結(jié)果

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到0.45 μm PVDF膜上，封閉液作用后、經(jīng)一抗、二抗孵育后ECL顯色，在30 000左右出現(xiàn)目的條帶(圖4)，說明表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性良好，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

M：蛋白marker；1、2： pET-30a- BP26 (+)。圖4 布魯氏菌BP26蛋白Western-Blot結(jié)果Fig.4 Western-blot results of Brucella BP26 protein

2.4 BP26蛋白基本性質(zhì)分析

ExpASy在線軟件分析結(jié)果顯示，BP26蛋白總長約為250個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量大小為26 550，等電點(diǎn)為6.39；帶正、負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)均為24。BP26蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為5 960 mol/L；BP26蛋白N端為Met，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)半衰期約為30 h，在酵母體內(nèi)半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)半衰期大于10 h。

BP26蛋白在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為27.93，推測BP26蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。BP26蛋白的脂肪族指數(shù)為92.16，親水性平均系數(shù)為-0.030，BP26屬跨膜蛋白且其外膜蛋白質(zhì)具有較高的親水性，屬親水蛋白質(zhì)。對BP26蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)α螺旋比例為41.20%，β轉(zhuǎn)角比例為4.80%，無規(guī)則卷曲比例為36.80%，延長鏈比例為17.20%，可見BP26蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主(圖5)。BP26蛋白的信號肽區(qū)域?yàn)榈?～28位氨基酸，信號肽剪切位點(diǎn)在28～29位氨基酸之間。對BP26蛋白的氨基酸序列中的抗原表位進(jìn)一步進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)顯示序列中存在8個(gè)潛在的抗原表位，平均抗原傾向性系數(shù)為1.016 4。

圖5 布魯氏菌BP26蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of Brucella BP26 protein

2.5 BM-DCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及純度檢測

在細(xì)胞因子rmGM-CSF和rmIL-4的共同作用下，4只BALB/C鼠分離的BM-DCs平均含量可達(dá)到1 ml 1.3×106細(xì)胞，符合試驗(yàn)要求。倒置顯微鏡觀察DCs的形態(tài)特征及生長狀況。在培養(yǎng)24 h后，可觀察到DCs體積較小，為均一的圓形，部分貼壁生長。至第3 d可觀察到DCs集落群并且DCs體積較第1 d的體積大。培養(yǎng)至第6 d，部分DCs脫離集落群，呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)并形成類似于樹杈狀的突起(圖6)。將培養(yǎng)第6 d的DCs用PE- CD11C染色標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀分析DCs活性，結(jié)果顯示：分離制備的DCs活性可達(dá)到85%以上(圖7)，符合試驗(yàn)要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A:骨髓原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h;B:誘導(dǎo)第3 d;C,D:誘導(dǎo)第6 d ；A,C,D:放大×20;B:放大×40。圖6 用含rmGM-SF和rmIL-4完全培養(yǎng)基不同時(shí)間誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)Fig.6 Induction of cell morphology at different time with complete medium containing rmGM-SF and rmIL-4

圖7 DCs活性Fig.7 Activity detection of dendritic cells

2.6 布魯氏菌BP26蛋白對DCs成熟及細(xì)胞因子表達(dá)

如圖8所示，LPS組與DC對照組相比，經(jīng)LPS刺激作用后，DCs的成熟呈促進(jìn)趨勢。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在BP26刺激BM-DCs后，試驗(yàn)組設(shè)置的CD40、MHC-Ⅱ、CD86和CD80的雙染區(qū)域比值與空白DC組對比后，有明顯的上升趨勢，故能判定布魯氏菌BP26蛋白對BM-DCs的成熟具有促進(jìn)作用。SPSS軟件分析結(jié)果顯示，LPS與BP26雖然對BM-DCs的成熟均有促進(jìn)作用，但APC-CD40、APC-CD80、FITC-CD86組中差異不明顯，而在FITC-MHCⅡ組中呈現(xiàn)出較明顯的差異。

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測BP26和LPS處理后DC表面共刺激分子的表達(dá)Fig.8 The expression of costimulatory molecules on dendritic cells treated with BP26 and LPS by flow cytometry

2.7 參與DCs炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子的檢測

如圖9所示，LPS組與DC對照組相比，經(jīng)LPS刺激作用后，TNF-α的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在BP26刺激BM-DCs后，IL-10的表達(dá)量與DC對照組相比呈下降趨勢且差異極顯著(P<0.01)，IL-12的表達(dá)量與DC對照組相比呈現(xiàn)下降趨勢且差異顯著(P<0.05)。分析結(jié)果說明，布魯氏菌BP26蛋白能夠引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放。

圖9 參與BM-DCs炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子顯著差異性分析Fig.9 Analysis of significant differences in cytokines involved in BM-DCs inflammatory response

3 討 論

本研究獲得了高效可溶的BP26重組蛋白，與預(yù)測結(jié)果相一致。純化后刺激BM-DCs的研究結(jié)果表明，BP26蛋白能促進(jìn)BM-DCs分化成熟及誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)MHCⅡ抗原提呈作用，并能對IL-10與IL-12的分泌產(chǎn)生抑制作用。

BP26蛋白作為布魯氏菌外膜蛋白質(zhì)家族重要的毒力因子[12]，對該蛋白質(zhì)的研究集中于利用BP26蛋白或其家族成員與其他毒力因子相連進(jìn)而制成多表位肽疫苗對動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)免疫，從而預(yù)防布魯氏菌病的發(fā)生[13]。但是對于BP26在刺激細(xì)胞后激活的信號通路和由此產(chǎn)生的活化信號的研究較少。此外，本試驗(yàn)通過生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)有大量親水性抗原區(qū)域暴露，親水性高，這與試驗(yàn)獲得高效可溶性表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)果一致。通過表達(dá)獲得的可溶性活性高的重組蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)與宿主互作功能研究奠定了可靠的基礎(chǔ)。

樹突狀細(xì)胞(DCs)是在抗原提呈中扮演著重要角色，目前研究認(rèn)為，DCs為體內(nèi)提呈功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞(APC)[14]，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者 。將此次試驗(yàn)構(gòu)建的重組蛋白BP26作為抗原刺激BM-DCs，通過流式細(xì)胞術(shù)分析BM-DCs表面標(biāo)志物的變化，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌BP26蛋白能促進(jìn)BM-DCs成熟分化，表明該蛋白質(zhì)參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)，在細(xì)菌對宿主細(xì)胞的侵入過程中發(fā)揮重要作用。

CD86是抗原呈遞細(xì)胞上的表達(dá)分子，可提供T細(xì)胞活化和存活所必需的共刺激信號[15]。它是T細(xì)胞表面上2種蛋白質(zhì)CD28抗原和CTLA-4的配體，其主要與CD28結(jié)合[16]，該蛋白質(zhì)與CD28抗原的結(jié)合是激活T細(xì)胞的共刺激信號。這些分子與CD80抗原一起提供必要的刺激，以引發(fā)T細(xì)胞抵抗抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原[17]。本研究發(fā)現(xiàn)重組BP26蛋白刺激BM-DCs后這些表面分子表達(dá)不同程度升高，表明該蛋白能夠活化T細(xì)胞反應(yīng)，而MHCⅡ表面分子表達(dá)顯著升高表明該蛋白質(zhì)通過MHCⅡ途徑提呈抗原。

CD80是CD86活化T淋巴細(xì)胞時(shí)的協(xié)同刺激因子，在自身免疫監(jiān)控、體液免疫應(yīng)答及移植反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[18]。CD80屬于免疫球蛋白超家族，其受體是CD28和CD152(CTLA4)[19-20]。CD80在活化B淋巴細(xì)胞、活化T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中均可表達(dá)；在非活化B淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、粒細(xì)胞及核細(xì)胞上不表達(dá)[21-22]，而多個(gè)研究結(jié)果表明，布魯氏菌感染宿主后能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的BP26蛋白相關(guān)表位的抗體[23-24]，細(xì)胞因子檢測結(jié)果證明BP26能夠激發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，刺激免疫細(xì)胞活化。本研究通過重組BP26蛋白抗原刺激BM-DCs后CD80表面分子升高，說明BP26在細(xì)菌侵入宿主引起機(jī)體產(chǎn)生免疫效應(yīng)的過程中發(fā)揮著重要的作用。