盧萬飄，藍(lán)劍鋒*，覃子龍

(1.玉林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 玉林 537000；2.柳州市食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006)

黃芪是我國常用傳統(tǒng)中藥材之一，因其藥用歷史悠久，臨床應(yīng)用廣泛。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。黃芪味甘性溫，歸脾、肺經(jīng)，有補(bǔ)氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫的功效，屬“補(bǔ)氣”之藥。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為“上品”，“主治癰疽久敗瘡，排膿止痛”，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血等功效[1]。黃芪主要含有黃酮類、皂苷類、多糖類、揮發(fā)油及其無機(jī)元素等活性成分[2-4]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有抗炎、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和抗病毒等藥理作用[5-6]。

本實驗通過篩選高效液相色譜的洗脫溶劑，選擇最優(yōu)色譜條件，建立高效液相色譜法檢測黃芪中山奈素含量的方法。選擇最常用的甲醇、乙醇、鹽酸-甲醇溶劑提取，在86 ℃水浴上回流提取1 h，測定中藥黃芪山奈素提取率，實驗結(jié)果顯示單純甲醇、乙醇提取不出山奈素，須加入適量鹽酸。黃芪中主要成分為皂苷類、黃酮類及多糖類，其中山奈素為黃芪有效成分之一，也作為黃芪質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。本次研究通過對不同產(chǎn)地黃芪藥材中山奈素的含量進(jìn)行檢測、對比、分析，旨在為提高黃芪藥材臨床應(yīng)用的科學(xué)性、合理性提供依據(jù)。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

Waters 2695高效液相色譜儀；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；AS7240BT超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；百萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器XP26)；元素1810A超純水器(上海摩勒科技有限公司)；HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實驗藥材

山奈素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110861-201906)。

色譜乙腈(德國，色譜純，批號：1797207537)；色譜甲醇(德國，色譜純，批號：1797260512)；磷酸、鹽酸、甲醇、冰乙酸(分析純AR)，試驗用水為超純水。

黃芪藥材來源于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江、遼寧、河北，經(jīng)鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。見表1。

表1 黃芪藥材信息

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱選擇：Thermo SCIENTIFIC Hypersil GOLD Dim.(mm)(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.1%磷酸(58∶42)，檢測波長370 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，按照上述條件各組分離度良好，見圖1。用鹽酸-甲醇(1∶4)溶液提取的黃芪提取液色譜和山奈素對照品色譜如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 黃芪樣品色譜

圖2 山奈素對照品色譜

圖3 空白溶劑色譜

2.1.2 對照品溶液的配制 稱取山奈素對照品10.21 mg，精密稱定，20%HCl-甲醇溶解，于50 mL量瓶定容，配成濃度204.2 μg/mL的對照品溶液，置于冰箱(2～8 ℃)中保存，備用。

2.1.3 供試品的制備 分別稱取不同產(chǎn)地的黃芪藥材1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20%HCl-甲醇20 mL，稱重，浸泡25 min，86 ℃回流提取1 h，冷卻加入20%HCl-甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取山奈素對照品溶液2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、12 μL、15 μL分別注入高效液相色譜儀，各進(jìn)樣1次，測定相應(yīng)條件下的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算相對應(yīng)的回歸方程。精密吸取上述山奈素對照品稀釋液，進(jìn)樣，測定其信號與噪聲比值，將S/N=3時的濃度定為檢測限(LOD)，將S/N=10時的濃度定為定量限(LOQ)。山奈素在含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

表2 黃芪中山奈素線性方程及線性范圍

2.2.2 精密度試驗 精密稱取黃芪粉末1.0 g，按照“2.1.3”項下的方法制備供試品，按“2.1.1”項下的色譜條件以及流動相條件進(jìn)樣，記錄各自的峰面積，連續(xù)進(jìn)行6次，并計算山奈素峰面積的RSD。結(jié)果測得山奈素峰面積的RSD值為0.78%，RSD小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。數(shù)據(jù)見表3。

表3 黃芪中山奈素精密度 (n=6)

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 稱取黃芪藥材1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15% HCl-甲醇25 mL，稱重，浸泡30 min，回流處理1 h，冷卻補(bǔ)足重量，搖勻，過微孔濾膜，即得供試品液，分別于在0、2、4、8、12、24 h按“2.1.1”項下的色譜條件以及流動相條件進(jìn)樣，測定各樣品的峰面積，結(jié)果測得黃芪藥材中山奈素峰面積的RSD值為1.75%，RSD值小于3.0%，說明樣品在24 h內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)見表4。

表4 黃芪中山奈素穩(wěn)定性 (n=6)

2.2.4 重復(fù)性試驗 精密稱取黃芪藥材粉末1.0 g，平行稱取6份，按“2.1.3黃芪樣品制備成樣品溶液”項下的方法，按“2.1.1”項下的色譜條件以及流動相條件進(jìn)樣，測定各樣品的峰面積，計算黃芪藥材中山奈素平均含量，結(jié)果測得黃芪藥材中山奈素的平均含量為142.08 μg/g，黃芪藥材中山奈素的RSD為2.10%，RSD值均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。數(shù)據(jù)見表5。

表5 黃芪中山奈素重復(fù)性 (n=6)

2.2.5 加樣回收試驗 精密稱取黃芪藥材粉末0.5 g，精密稱定6份，每組精密加入適量山奈素對照品溶液，按“2.1.3黃芪藥材樣品制備成樣品溶液”項下的方法，按“2.1.1”項下的色譜條件以及流動相條件進(jìn)樣，計算黃芪中山奈素的平均回收率和其RSD值，該方法準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見表6。

表6 黃芪加樣回收率實驗數(shù)據(jù)

2.3 樣品含量測定

分別精密稱定不同產(chǎn)地黃芪藥材粉末1.0 g，每個產(chǎn)地稱取3份，按“2.1.3黃芪樣品制備成樣品溶液”項下的方法，按“2.1.1”項下的色譜條件以及流動相條件進(jìn)樣，通過外標(biāo)一點(diǎn)法計算黃芪中山奈素的平均含量。結(jié)果見表7。

表7 黃芪平均含量測定結(jié)果

3 討論

采用HPLC色譜法測定黃芪藥材中山奈素的含量，供試品液制備中，分別比較提取溶劑體積(15、25、35和45 mL)、提取時間(30、60、90 min)及鹽酸濃度(10%、15%、20%、25%、30%)對黃芪化學(xué)成分提取效果的影響。通過單因素考擦得出最佳提取工藝：黃芪粉末1.0 g，加入25 mL 20% HCl-甲醇，回流提取60 min。

通過紫外可見光分光光度計對中藥黃芪供試品進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在274 nm、370 nm和375 nm處均有吸收峰，實驗表明，在274 nm和375 nm的波長下基線不平，干擾峰較多，分離度較差，而在370 nm波長下基線較平穩(wěn)且干擾峰最少，峰與峰之間可得到較好的分離，出峰時間適宜，這與文獻(xiàn)報道相一致，故確定檢測波長為370 nm。

中藥黃芪中黃酮類成分的藥理作用對心血管疾病、糖尿病、抗腫瘤、抗衰老等有較高的藥用價值。本文只對其中一種黃酮類成分山奈素進(jìn)行了分析，內(nèi)蒙古產(chǎn)的黃芪中山柰素含量明顯高于其他5個產(chǎn)地的中藥黃芪，而河北產(chǎn)的黃芪藥材山奈素含量最低，但要確定6個不同產(chǎn)地的黃芪品質(zhì)，還需要從總黃酮含量及其他有效成分如黃芪多糖、黃芪皂苷和揮發(fā)油等方面進(jìn)行綜合評價。