尹 磊，朱月健*，葛德助，楊國(guó)祥，李冬梅

(1.安徽普仁中藥飲片有限公司，安徽 亳州 236800；2.中藥提取安徽省技術(shù)創(chuàng)新中心，安徽 亳州 236800；3.安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800；4.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

川烏為毛茛科植物烏頭的干燥母根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品。本品初生發(fā)芽長(zhǎng)出地面時(shí)，形如烏鴉之頭，故名烏頭。因主產(chǎn)于四川省，故又名川烏。6月下旬至8月上旬采挖，除去子根、須根、泥沙，曬干。其味辛、苦、熱，有大毒。川烏主要有效成分為雙酯型生物堿，其也是川烏的毒性成分。通過(guò)加熱、水解等方式能使雙酯型生物堿轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^低的單酯型生物堿，若進(jìn)一步水解為相應(yīng)的醇胺，則幾乎無(wú)毒性[1]。因此川烏的合理炮制對(duì)控制用藥安全有效尤為重要。

烏頭屬植物多含有生物堿，生藥所含的雙酯型生物堿具有較大的毒性，自古代即對(duì)其炮制過(guò)程有了較多記載，包括“炮”“燒”“泡”等方法。近代通過(guò)現(xiàn)在的設(shè)備和技術(shù)應(yīng)用，對(duì)其炮制過(guò)程和原理也有了較多的研究，王峰峰等[2-3]對(duì)烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿水解和醇解產(chǎn)物進(jìn)行分析，明確了烏頭堿水解成單酯型新烏頭堿，最后到次烏頭堿的水解過(guò)程。秦語(yǔ)欣等[4]分析了川烏炮制前后化學(xué)成分的變化，也指出了生物堿水解過(guò)程。

對(duì)于烏頭的炮制工藝研究，涂瑤生等[5]采用加壓蒸制法炮制川烏，使其在111 ℃(0.05MPa)下炮制15～150 min即能達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。區(qū)炳雄等[6]研究表明，微波炮制能明顯降低川烏中毒性成分雙酯型生物堿的含量，與藥典規(guī)定炮制方法比較，其總生物堿含量較高。龔潮池等[7]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)制川烏最佳浸泡方式為40 ℃溫水浸泡25～26 h，可明顯縮短制川烏浸泡時(shí)間。鄧廣海等[8]研究發(fā)現(xiàn)，高壓蒸制30 min后，川烏毒性成分雙酯型生物堿含量明顯降低，且與蒸制時(shí)間有顯著的相關(guān)性，時(shí)間延長(zhǎng)，含量逐漸降低，到180 min后，其含量幾乎檢測(cè)不到，但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，總生物堿含量也有所降低。上述研究的工藝方法均為實(shí)驗(yàn)室小批量炮制過(guò)程，對(duì)于企業(yè)實(shí)際大生產(chǎn)工藝指導(dǎo)有一定的局限性，而且川烏炮制不當(dāng)，即炮制程度不夠(殘留毒性太大)或炮制太過(guò)(有效成分流失)，使得市場(chǎng)上很多川烏炮制品的質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，臨床上時(shí)常發(fā)生川烏及制川烏中毒和療效降低等現(xiàn)象[14]。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)合2015版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)資料和飲片企業(yè)加工實(shí)際，進(jìn)行工藝研究，通過(guò)工藝小試和大生產(chǎn)實(shí)際，探究制川烏蒸制時(shí)間、浸泡時(shí)間對(duì)有毒成分及有效成分的影響，形成穩(wěn)定可靠的生產(chǎn)工藝。

1 材料與試劑

川烏藥材(由安徽普仁中藥飲片有限公司提供)，取自原料庫(kù)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)謝冬梅老師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥母根。

電磁爐(廣東美的生活電器制造有限公司)、蒸鍋(佳合不銹鋼制品有限公司)、全自動(dòng)平面往復(fù)式刨片機(jī)(亳州市姜氏制藥設(shè)備有限公司)、UITiMate3000高效液相色譜儀(美國(guó)戴安(中國(guó))有限公司)、電子分析天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)、GZX-9246MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)

苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品(批號(hào)：11794-201802)、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品(批號(hào)：11796-201803)、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品(批號(hào)：11795-201804)、烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)：112019-201801)、次烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)：110798-201809)、新烏頭堿對(duì)照品(批號(hào)：110799-201708)，6種生物堿對(duì)照品購(gòu)買于中國(guó)食品藥品檢定研究院；異丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈和四氫呋喃為分析純；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動(dòng)相A，以0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.2 對(duì)照品溶液制備

取對(duì)照品適量，精密稱定，加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL含烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿各50 μg、次烏頭堿和新烏頭堿各0.15 mg、苯甲酰新烏頭原堿0.3 mg的混合溶液，即得，備用。

2.3 川烏炮制方法考察

2.3.1 浸泡時(shí)間考察 分別取2批次生川烏大小分開(kāi)，加水使其沒(méi)過(guò)藥材浸泡，每天換水1次，記錄1次時(shí)間，記錄總浸泡時(shí)間，取出蒸制7h，取出，晾至六成干，切片，干燥，得制川烏。川烏浸泡時(shí)間對(duì)浸泡程度影響見(jiàn)表2。

表2 制川烏浸泡時(shí)間對(duì)浸泡程度影響

2.3.2 蒸制時(shí)間考察 取生川烏大小分開(kāi)，用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心，記錄浸泡時(shí)間，取出，分別蒸制4、5、6、7、8、9 h，取出，晾至六成干，切片，干燥，得制川烏。每批次平行操作2次，得制川烏12批。

2.4 供試品溶液的制備

取制川烏粉末(過(guò)三號(hào)篩)約2g ，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25 ℃以下)30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤氘惐?三氯甲烷(1∶1)混合溶液3 mL溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積、保留時(shí)間。結(jié)果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD(n=5)分別為2.80%、1.90%、2.04%、1.44%、2.47%、2.82%。保留時(shí)間的RSD(n=5)分別為0.43%、0.05%、0.84%、0.98%、0.95%、1.44%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液，在室溫下分別于0、2、4、8、10、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積、保留時(shí)間。結(jié)果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD分別為2.76%、2.74%、1.90%、2.72%、2.60%、2.54%。保留時(shí)間的RSD分別為0.65%、0.51%、0.15%、1.10%、0.15%、1.31%。結(jié)果表明樣品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品粉末6份，分別按“2.4”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液各20 μL，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積、保留時(shí)間。結(jié)果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿峰面積的RSD(n=6)分別為1.87%、2.65%、1.99%、1.63%、1.93%、2.18%。保留時(shí)間的RSD(n=6)分別為0.20%、0.31%、0.29%、0.84%、0.13%、1.18%。結(jié)果說(shuō)明該方法測(cè)定烏頭中6種生物堿的重復(fù)性良好。

2.8 樣品含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3、表4、圖1、圖2。

表4 不同蒸制時(shí)間對(duì)制川烏生物堿含量影響

表3 不同浸泡時(shí)間對(duì)制川烏生物堿含量影響

根據(jù)表3，繪制兩批號(hào)制川烏單酯型生物堿成分的浸泡時(shí)間-含量關(guān)系，見(jiàn)圖1。

圖1 制川烏單酯型生物堿成分的浸泡時(shí)間-含量關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)選取2個(gè)不同批號(hào)川烏進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各個(gè)批號(hào)川烏均在浸泡3天(室溫)后達(dá)到2015版《中國(guó)藥典》內(nèi)無(wú)干心的要求(表2)，由表3檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，8個(gè)批次浸泡不同時(shí)間所得制川烏雙酯型生物堿和單酯型生物堿含量均在2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定范圍內(nèi)。

由圖1可見(jiàn)，同一批號(hào)不同浸泡時(shí)間所得制川烏單酯型生物堿總量差距較小，說(shuō)明浸泡時(shí)間對(duì)制川烏雙酯型生物堿影響較小。根據(jù)企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)情況考慮，制川烏浸泡3天符合2015版《中國(guó)藥典》且能大大縮短生產(chǎn)制川烏成品時(shí)間。綜上所述，企業(yè)生產(chǎn)制川烏室溫浸泡3天應(yīng)為最優(yōu)參數(shù)。

根據(jù)表4繪制兩批次制川烏單酯型生物堿成分的蒸制時(shí)間-含量關(guān)系，見(jiàn)圖2。

圖2 制川烏單酯型生物堿成分的蒸制時(shí)間-含量關(guān)系

由表4及圖2可見(jiàn)，制川烏蒸制6 h后雙酯型生物堿已經(jīng)完全檢測(cè)不到，說(shuō)明雙酯型生物堿在蒸制6 h后已經(jīng)水解完全。制川烏中單酯型生物堿在蒸制7 h前呈逐漸升高趨勢(shì)，蒸制7 h達(dá)到峰值，之后隨蒸制時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。

蒸制6～8 h的川烏單酯型生物堿總量基本達(dá)到2015版《藥典》所規(guī)定的0.070%～0.15%，說(shuō)明2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定制川烏蒸制6～8 h的合理性。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)以單酯型生物堿為衡量標(biāo)準(zhǔn)，并明確了制川烏蒸制在7h單酯型生物堿總量達(dá)到最高。

2.9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)所得工藝參數(shù)，選取3個(gè)批號(hào)生川烏(批號(hào)1904111、1904112、1904121)進(jìn)行大生產(chǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，每批平行操作2次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3批次制川烏生物堿含量測(cè)定結(jié)果

通過(guò)驗(yàn)證結(jié)果可知，3個(gè)批次制川烏符合2015版《中國(guó)藥典》所要求的雙酯型生物堿不得過(guò)0.040%，單酯型生物堿總量0.070%～0.15%。由實(shí)驗(yàn)研究得到的制川烏工藝參數(shù)在大生產(chǎn)中穩(wěn)定可靠，可為企業(yè)批量生產(chǎn)制川烏提供參考。

3 討論

生川烏毒性劇烈，必須經(jīng)過(guò)炮制方能有藥用價(jià)值。但針對(duì)制川烏2015版《中國(guó)藥典》并未給出明確的炮制工藝參數(shù)。本文在2015版《中國(guó)藥典》的基礎(chǔ)上，運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定制川烏中生物堿總量的多少，探究并優(yōu)化了制川烏具體炮制工藝參數(shù)。

在蒸制時(shí)間上，本文對(duì)同一批號(hào)的川烏進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，從蒸制4 h開(kāi)始，每隔1 h取樣1次，取樣到蒸制9 h，總計(jì)6個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度。結(jié)果表明，制川烏在蒸制6 h后雙酯型生物堿已基本檢測(cè)不到，單酯型生物堿總量在蒸制4～7 h期間逐漸升高，7 h達(dá)到峰值，而后逐漸降低。原因可能是蒸制7 h之前川烏中雙酯型生物堿不斷轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿，從而使其不斷升高；7 h后單酯型生物堿繼續(xù)水解為醇胺類物質(zhì)而沒(méi)有雙酯型生物堿繼續(xù)轉(zhuǎn)化。在此建議企業(yè)生產(chǎn)制川烏蒸制7 h最佳。

在浸泡時(shí)間上，本文根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的“內(nèi)無(wú)干心”進(jìn)行浸泡，設(shè)置4個(gè)浸泡時(shí)間梯度，實(shí)驗(yàn)了2個(gè)不同批號(hào)的生川烏，結(jié)果表明川烏在浸泡3天后達(dá)到2015版《中國(guó)藥典》所規(guī)定的“內(nèi)無(wú)干心”標(biāo)準(zhǔn)，含量測(cè)定結(jié)果表明浸泡3天制川烏生物堿含量符合2015版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，浸泡時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)制川烏生物堿含量影響不大。綜合企業(yè)生產(chǎn)效率考慮，建議生產(chǎn)制川烏浸泡時(shí)間3天最佳。

綜上所述，制川烏炮制最佳工藝參數(shù)為：去除雜質(zhì)，于室溫下加水浸泡3天，采用蒸制方法隔水蒸制7 h，切片，烘干即得。此工藝參數(shù)投入大生產(chǎn)中產(chǎn)出的制川烏性狀、限量、含量都符合2015版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)制川烏的工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。