周 和，張 強(qiáng)，楊輝燦，馮 華，王 奧

(1.遵義市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 遵義 563002；2.遵義產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 遵義 563002)

心腦疏通膠囊是由川芎、丹參、法半夏、杜仲、茯苓等十一味中藥材制成的醫(yī)院制劑[1]，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效，用于氣虛血滯、脈絡(luò)瘀阻所致中風(fēng)后遺癥，半身不遂、肢體麻木及胸痛、胸悶、心悸、眩暈、健忘及心腦血管供血不足等證候者[2]。該中藥復(fù)方制劑具有處方復(fù)雜、多指標(biāo)成分協(xié)調(diào)作用的特點(diǎn)。依據(jù)現(xiàn)有研究，丹參中丹參酮類(lèi)化合物具有抗菌消炎、祛瘀止痛的作用[3-5]，是該制劑發(fā)揮功效的指標(biāo)性成分之一；而現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)比較簡(jiǎn)單，缺乏指標(biāo)性成分含量的檢測(cè)，難以有效控制其質(zhì)量。因此，本研究建立了心腦疏通膠囊的薄層鑒別與HPLC法同時(shí)測(cè)定兩種丹參酮類(lèi)成分的含量[6-9]。薄層鑒別用于判斷投料藥材的真?zhèn)?，含量測(cè)定用于評(píng)價(jià)指標(biāo)性成分的多少，以期為心腦疏通膠囊的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜議(安捷倫公司：包括四元泵，DAD檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent1260工作站和處理軟件)，Waters XSelect C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；MS204TS型梅特勒電子天平(北京中恒日鑫科技有限公司)；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

丹參酮IIA、隱丹參酮(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：110766-201721、110852-201605)；3批心腦疏通膠囊(批號(hào)分別為：161201、161202、161203)購(gòu)買(mǎi)于遵義市中醫(yī)院；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，20170805)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；甲苯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，20170509)，乙酸乙酯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，20170512)，乙醚(成都金山化學(xué)試劑有限公司，20180202)，均為分析純；硅膠G板(青島海洋化工廠有限公司，20170818)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

取本品內(nèi)容物5 g，置索氏提取器中，加入乙醚適量，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺丹參藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取丹參酮ⅡA對(duì)照品、隱丹參酮對(duì)照品，加乙酸乙酯制成濃度為2 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(18∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果表明，分離度良好，斑點(diǎn)清晰。見(jiàn)圖1。

注：s.混合對(duì)照品溶液；Y.陰性樣品溶液；1-3.樣品溶液

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：waters XSelect C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(洗脫程序，見(jiàn)表1)；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 溶液制備 對(duì)照品溶液制備：稱(chēng)取丹參酮IIA、隱丹參酮對(duì)照品適量，分別用甲醇溶解制成含丹參酮IIA 212.63 μg/mL、隱丹參酮47.52 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，于4 ℃冰箱中保存，備用。再分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、5 mL置100 mL容量瓶中，精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配置成5個(gè)系列的混合對(duì)照品溶液(含丹參酮ⅡA：2.126，4.253，10.632，21.263，42.526 μg/mL；隱丹參酮0.475，0.950，2.376，4.752，9.504 μg/mL)，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

供試品溶液制備：取心腦疏通膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約3.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入乙醚50 mL，靜置24 h(時(shí)時(shí)振搖)，過(guò)濾，濾液蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過(guò)，即得。

陰性溶液制備：按處方量制成缺丹參藥材的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成陰性溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性 取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定(圖2)。由圖2可知，混合對(duì)照品分離良好，理論塔板數(shù)高于5 000。供試品溶液基本達(dá)到基線分離，陰性樣品無(wú)干擾。

圖2 混合對(duì)照品(A)、樣品(B)、陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 取上述“2.2.2”項(xiàng)下5個(gè)系列混合對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)，以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)。由表2可知，兩種丹參酮類(lèi)成分在線性范圍內(nèi)線性良好。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，丹參酮ⅡA和隱丹參酮峰面積RSD分別為0.31%、0.57%(n=6)，表明儀器精密度好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取心腦疏通膠囊(批號(hào)：161201)內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，共6份，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，丹參酮IIA峰面積的RSD為1.08%(n=6)，隱丹參酮峰面積RSD為1.35%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取心腦疏通膠囊(批號(hào)：161201)同一供試品溶液，分別在0、2、5、8、12、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，丹參酮ⅡA和隱丹參酮峰面積RSD均小于1.89%(n=6)，表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量(丹參酮ⅡA 43.170 μg、隱丹參酮13.038 μg/g)的同一批號(hào)心腦疏通膠囊樣品(批號(hào)：161201)6份，每份約1.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入丹參酮ⅡA和隱丹參酮對(duì)照品適量，按供試品溶液制備的方法操作，進(jìn)樣檢測(cè)并計(jì)算回收率(表3)。從結(jié)果來(lái)看，丹參酮IIA平均回收率為99.31%，RSD為0.43%，隱丹參酮平均回收率為99.78%，RSD為0.89%，表明回收率良好。

表3 加樣回收率試驗(yàn) (n=6)

2.2.9 樣品測(cè)定 取3批心腦疏通膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定心腦疏通膠囊中兩種丹參酮類(lèi)成分的含量，見(jiàn)表4。

表4 樣品含量 (n=3)

3 討論

丹參酮類(lèi)是丹參中脂溶性成分，包括丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I等[7]，因此，本研究對(duì)比考察了甲醇、乙醚兩種有機(jī)溶劑作為提取溶劑的試驗(yàn)結(jié)果?？疾旖Y(jié)果表明，由于心腦疏通膠囊中藥味多，甲醇提取液的色譜峰繁雜，不易分離；以乙醚提取、甲醇溶解時(shí)，基線較平穩(wěn)，各色譜峰保留時(shí)間適中，故選擇乙醚提取。在色譜圖中，成功定位出了丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I三種丹參酮類(lèi)成分，其中，以丹參酮IIA和隱丹參酮含量較高，利于定量檢測(cè)分析，方法學(xué)考察結(jié)果亦符合要求。此外，經(jīng)多次梯度洗脫模式摸索，對(duì)甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-醋酸溶液、乙睛-水、乙睛-磷酸溶液、乙睛-醋酸溶液6個(gè)流動(dòng)相考察發(fā)現(xiàn)：乙腈-0.1%磷酸溶液對(duì)樣品成分的梯度洗脫效果最好。本研究首次建立了心腦疏通膠囊中丹參酮類(lèi)成分的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可為心腦疏通膠囊的質(zhì)量控制提供參考。