何厚洪，姚建標(biāo)，暢文琦，王建方，應(yīng) 珂，羅婷婷，金漢臺(tái)，薛 瑾，王如偉*

(1.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052；2.浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052；3.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水 323400)

復(fù)方魚(yú)腥草合劑由魚(yú)腥草、黃芩、板藍(lán)根、金銀花、連翹五味中藥組成，在臨床上主要用于外感風(fēng)熱引起的急性咽炎、扁桃腺炎。截至目前，部頒標(biāo)準(zhǔn)中復(fù)方魚(yú)腥草合劑的含量測(cè)定僅以黃芩苷作為指標(biāo)，而復(fù)方中成藥具有多成分、復(fù)雜的特點(diǎn)，單一指標(biāo)已不足以全面反映和控制合劑的質(zhì)量。目前，對(duì)于復(fù)方魚(yú)腥草的質(zhì)量研究多為單一或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)，如黃芩苷、連翹苷、綠原酸等的HPLC含量測(cè)定[1-2]或指紋圖譜研究[3]，缺乏對(duì)復(fù)方魚(yú)腥草合劑整體化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)研究。

為了快速系統(tǒng)鑒定復(fù)方魚(yú)腥草合劑中的化學(xué)物質(zhì)成分，本研究采用HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS技術(shù)對(duì)復(fù)方魚(yú)腥草合劑進(jìn)行定性分析，快速鑒別復(fù)方魚(yú)腥草中的化學(xué)成分，并對(duì)鑒定出的成分進(jìn)行藥味與大類成分的歸屬，為提升復(fù)方魚(yú)腥草合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥理作用機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)和方向。

1 材料

1.1 儀器

戴安 UltiMate 3000超高效液相-軌道質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括在線脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器以及ESI離子源。

1.2 藥材與試劑

甲醇(色譜純，Merck)；甲酸(色譜純，百靈威)；試驗(yàn)用水為Milli-Q系統(tǒng)制備(電阻率18.2 MΩ，25 ℃)。對(duì)照品黃芩苷(批號(hào)110715-201821)、漢黃芩苷(批號(hào)112002-201702)、漢黃芩素(批號(hào)111514-201706)、連翹酯苷A(批號(hào)111810-201707)、連翹酯苷B(批號(hào)111811-201603)、當(dāng)藥苷(批號(hào)111742-200501)、異槲皮苷(批號(hào)111809-201804)、綠原酸(批號(hào)110753-201817)、金絲桃苷(批號(hào)111521-201809)、槲皮苷(批號(hào)111538-201606)、連翹苷(批號(hào)110821-201816)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。魚(yú)腥草(批號(hào)Z001a-180301)、黃芩(批號(hào)1804004)、板藍(lán)根(批號(hào)Z003c-180401)、金銀花(批號(hào)1803002)、連翹(批號(hào)Z004b-180301)、復(fù)方魚(yú)腥草合劑(批號(hào)B181001)均由浙江康恩貝中藥有限公司提供。

2 方法

2.1 色譜質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0～5 min，5%B；5 ～10 min，5% B→20% B；10～20 min，20% B→ 30% B；20～30 min，30% B→38% B；30～38 min，38% B；38～60 min，38% B→55% B；60～65 min，55% B→65% B；65～66 min，65% B→95% B；66～70 min，95% B。然后接著運(yùn)行10 min；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源溫度：350 ℃(±)；鞘氣流速：40 arb(+)，35arb(-)；保護(hù)氣流速：10 arb(±)；尾吹氣流速：0 arb(±)；噴霧電壓：3.2 kV(±)；毛細(xì)管溫度：325 ℃(+)，300 ℃(-)。所有樣品數(shù)據(jù)采集均采用全掃描模式，分辨率為 60 000 FWHM。一級(jí)全掃描質(zhì)量數(shù)范圍m/z 120～1 200；二級(jí)采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，設(shè)置閾值1 000以上的母離子作為掃描對(duì)象，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)為15 s，重復(fù)掃描次數(shù)設(shè)為 2次，重復(fù)掃描時(shí)間設(shè)為15 s，碰撞誘導(dǎo)解離電壓為35 V。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、連翹酯苷A、連翹酯苷B、當(dāng)藥苷、異槲皮苷、綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷、連翹苷對(duì)照品適量，加甲醇制備終濃度均約為50 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱備用。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材魚(yú)腥草2 g、黃芩2 g、板藍(lán)根2 g、金銀花2 g和連翹2 g，分別置于100 mL錐形瓶中，加水煎煮2次，合并煎煮液，減壓濃縮至密度約為1.2，加入適量86%乙醇至藥液中酒精含量為70%，醇沉靜置過(guò)夜，藥液過(guò)濾后減壓濃縮至無(wú)醇味，置于4 ℃冰箱保存。臨用前用純水稀釋10倍，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得各藥材供試品溶液。將復(fù)方魚(yú)腥草合劑直接濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得合劑供試品溶液。

3 結(jié)果

采用建立的HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS方法對(duì)復(fù)方魚(yú)腥草合劑進(jìn)行了分析，其正負(fù)離子模式下的總離子流見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方魚(yú)腥草合劑正負(fù)離子模式下總離子流

根據(jù)正負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜，確定其分子離子峰，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析其二級(jí)碎片信息，可推斷化合物的部分結(jié)構(gòu)。最后比較對(duì)照品的色譜質(zhì)譜行為，確認(rèn)化合物。若無(wú)相應(yīng)對(duì)照品，還需要比對(duì)合劑與各藥材的總離子流圖，先確認(rèn)峰歸屬，再通過(guò)pubmed、hmdb、massbank等化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)以及對(duì)應(yīng)藥材的相關(guān)文獻(xiàn)[4-17]推斷最有可能的化合物。最終從復(fù)方魚(yú)腥草合劑中歸屬了107個(gè)化學(xué)成分，其中包括7個(gè)氨基酸，11個(gè)苯乙醇苷，3個(gè)核苷，11個(gè)環(huán)烯醚萜，39個(gè)黃酮、12個(gè)木脂素、8個(gè)生物堿、14個(gè)有機(jī)酸，另有2個(gè)輔料峰。進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行藥味歸屬，最終在魚(yú)腥草中歸屬了22個(gè)，黃芩中40個(gè)，板藍(lán)根中27個(gè)，連翹中31個(gè)，金銀花中32個(gè)，部分化合物存在于多味藥材中。各化合物的基本信息見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方魚(yú)腥草合劑化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)表征

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

從歸屬結(jié)果看，部分化合物來(lái)源與藥材也具有一定的對(duì)應(yīng)性。如黃酮主要來(lái)源于黃芩，環(huán)烯醚萜主要來(lái)源于金銀花，苯乙醇苷主要來(lái)源于連翹等，這些化合物普遍具有抗炎、抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫等藥理活性[18-20]，以下為該三類特征化合物的基本裂解模式。

3.1 黃酮類化合物

從復(fù)方魚(yú)腥草合劑中共鑒定出黃酮類成分39個(gè)，其中黃酮苷的二級(jí)質(zhì)譜圖具有特征性，一般呈現(xiàn)出較高的苷元的信號(hào)響應(yīng)。例如黃芩苷(83)分子離子[M+H]+為447.091 4，負(fù)離子模式下的一級(jí)譜中還可見(jiàn)[2M-H]-m/z 891.157 8與源內(nèi)裂解產(chǎn)生的苷元信號(hào)m/z 269.044 6。通過(guò)Xcalibur軟件推斷可能的分子式為C21H18O11，偏差在5 ppm以內(nèi)。在二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)m/z 269.045 4 [M-178-H]-，可能為脫去一分子葡萄糖醛酸，結(jié)合對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)該峰確為黃芩苷。黃酮苷元?jiǎng)t可能發(fā)生RDA裂解，產(chǎn)生特征的碎片離子，如白楊素(104)分子離子[M+H]+為255.065 7，[M-H]-為253.050 5，根據(jù)精確分子量推測(cè)化學(xué)式為C15H10O4。在二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)m/z 153.018 5 [M-C8H6+H]+，為黃酮苷元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生的1，3A+碎片。

(a)黃芩苷(b)白楊素

3.2 環(huán)烯醚萜類化合物

從復(fù)方魚(yú)腥草合劑中共鑒定出環(huán)烯醚萜類成分11個(gè)，主要來(lái)源于金銀花。以馬錢苷酸(22)為例，其分子離子[M+Na]+為399.125 8，[M-H]-為375.129 6，根據(jù)精確分子量推測(cè)分子式為C16H24O10。二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)m/z 213.076 7為 [M-162-H]-，結(jié)構(gòu)中可能存在一分子六碳糖，m/z 169.087 1母核脫去CO2，m/z 151.0764為進(jìn)一步脫去一分子水。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)該化合物為馬錢苷酸，而另一個(gè)同分異構(gòu)體為7-epi馬錢苷酸。

3.3 苯乙醇苷類化合物

從復(fù)方魚(yú)腥草合劑中共鑒定出苯乙醇苷類成分11個(gè)，主要來(lái)源于連翹。以連翹酯苷A(51)為例，其分子離子[M+Na]+為647.194 6，[M-H]-為623.194 6，根據(jù)精確分子量推測(cè)分子式為C29H36O15。二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)m/z 461.165 6為[M-C9H8O3-H]-，m/z 443.155 9為[M - C9H8O3-H2O-H]-，推測(cè)結(jié)構(gòu)中含有一分子六碳糖，另可見(jiàn)m/z 315.108 5的二羥基苯乙醇苷母核碎片。結(jié)合對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)該峰確為連翹酯苷A。

圖3 環(huán)烯醚萜類成分典型裂解模式示例

4 討論

中藥具有療效好、成本低、相對(duì)低毒性的特點(diǎn)，但其復(fù)雜的化學(xué)成分及藥效物質(zhì)不明確致使中藥質(zhì)量控制與藥理機(jī)制研究困難重重，因此對(duì)中藥及其相關(guān)制劑進(jìn)行全面的化學(xué)表征非常必要，對(duì)于明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究意義重大。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)高效準(zhǔn)確的復(fù)雜體系快速分析成為可能，通過(guò)化合物的質(zhì)譜一級(jí)、二級(jí)信息，可快速獲取其結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)結(jié)合龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)還可以探索未知成分、挖掘中藥中潛在的有效物質(zhì)。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于化合物結(jié)構(gòu)鑒定可為中藥多組分鑒定研究提供更可靠的依據(jù)。

本研究通過(guò)建立HPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS方法，初步鑒定了復(fù)方魚(yú)腥草合劑中107個(gè)化合物，首次系統(tǒng)明確了復(fù)方魚(yú)腥草合劑的整體化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)方魚(yú)腥草合劑成分的快速定性分析，且該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高。此外，藥味歸屬的結(jié)果反映了合劑中各藥材的特征性成分，如槲皮苷(魚(yú)腥草)、9(S)，10(S)，11(R)-三羥基-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸(板藍(lán)根)、連翹苷(連翹)、黃芩苷(黃芩)、獐芽菜苷(金銀花)等，對(duì)合劑質(zhì)控指標(biāo)的篩選和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升具有重要作用，為彌補(bǔ)復(fù)方魚(yú)腥草合劑單一檢測(cè)指標(biāo)的不足提供依據(jù)。通過(guò)結(jié)合相關(guān)化合物的藥理活性報(bào)道，可以側(cè)面反映復(fù)方魚(yú)腥草合劑抗炎、抗菌等作用，對(duì)于合劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明也具有重要意義。

圖4 苯乙醇苷類成分典型裂解模式示例