史黎萍 ，徐 軍，徐燕豐，張立超，李 毅

(1.上海市中醫(yī)醫(yī)院 制劑室，上海 200000；2.上海市靜安區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，上海 200000)

復(fù)方荊參溶液是上海市中醫(yī)醫(yī)院皮膚科原主任顧乃芳的家傳經(jīng)驗(yàn)方劑，主要用于治療鵝掌風(fēng)、腳濕氣，尤其對(duì)于角化過度型的患者具有獨(dú)特的治療功效，一般用法是在夏季進(jìn)行浸泡，治療手足癬，尤其是角化過度型手足癬[1]。對(duì)革蘭陽性細(xì)菌、真菌和念珠菌具有顯著的抗菌活性，用藥安全性高，應(yīng)用前景廣闊[2]。2015版《中國(guó)藥典》中對(duì)非無菌產(chǎn)品微生物控制標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)趨于一致，與國(guó)際ICH要求統(tǒng)一協(xié)調(diào)，另外《中國(guó)藥典》也強(qiáng)調(diào)了藥品無菌與微生物限度檢查方法的建立和驗(yàn)證方面的標(biāo)準(zhǔn)[3]。本文按照《中國(guó)藥典》通則要求[4]對(duì)復(fù)方荊參溶液的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，以及控制菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢查方法進(jìn)行了適用性試驗(yàn)，以期為《中國(guó)藥典》中有關(guān)內(nèi)容的貫徹執(zhí)行提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器，SPX-100B-2生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；BHC-1000A/B2生物安全柜，SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)(吳江生信空氣凈化設(shè)備廠)；T3000Y電子天平(常熟雙杰測(cè)試儀器廠)；MJX-250霉菌培養(yǎng)箱(上海申賢恒溫設(shè)備廠)；SQP型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KD3090A2電動(dòng)吸引器(武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司)；無菌檢查薄膜濾器(浙江寧海白石藥檢儀器廠)。

1.2 樣品

復(fù)方荊參溶液(500 mL/瓶，上海市中醫(yī)醫(yī)院)(生產(chǎn)批次20180103、20180111、20180119)。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：3303077)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：3303027)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)：3303107)，沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào)：3302126)均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10 104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63 501]，白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉[CMCC(F) 98 003]購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.5 稀釋液及沖洗液

pH=7.0無菌NaCl-蛋白胨緩沖溶液(批號(hào)：3302140，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80(批號(hào)：101720160905，湖南爾康制藥股份有限公司)的pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于“1.3”項(xiàng)下中胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35 ℃培養(yǎng)24 h；白色念珠菌則接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25 ℃培養(yǎng)72天。上述培養(yǎng)物用“1.5”項(xiàng)下的緩沖溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25 ℃培養(yǎng)7天，加入5 mL “1.5”項(xiàng)下的緩沖溶液，將孢子進(jìn)行洗脫，收集孢子懸液，用“1.5”項(xiàng)下含0.05%(mL/mL)緩沖溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10 mL，加pH=7.0無菌NaCl-蛋白胨緩沖溶液至100 mL，制成1∶10供試液。

2.3 需氧菌計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 方法選擇 因采用平皿法需氧菌總數(shù)、霉菌酵母菌菌總數(shù)回收率未達(dá)到0.5～2，故采用薄膜過濾法。

2.3.2 接種 ①試驗(yàn)組取制備好的1∶10供試液1 mL薄膜過濾法過濾，每張薄膜用沖洗液分別試驗(yàn)沖洗1次2次、3次，每次100 mL/次。最后一次沖洗液中分別加入≤100 cfu/mL 5種試驗(yàn)菌液1 mL；②供試品對(duì)照組取制備好的1∶10供試液1 mL，不加入試驗(yàn)菌；③菌液對(duì)照組不加供試品，步驟同試驗(yàn)組。取制備好的濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基上，按規(guī)定條件倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)，計(jì)算各組平均菌落數(shù)。

2.3.3 結(jié)果 試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值在0.5～2范圍內(nèi)，供試品需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)通過，見表1。

表1 需氧菌總數(shù)測(cè)定供試品微生物回收試驗(yàn)結(jié)果 (1∶10供試液)

表1結(jié)果顯示，五種試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)符合藥典要求，可取1∶10供試液1 mL薄膜法沖洗300 mL進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)通過。

2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

方法同需氧菌總數(shù)適用性試驗(yàn)。試驗(yàn)菌為白色念珠菌和黑曲霉，結(jié)果見表2。

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定供試品微生物回收試驗(yàn)結(jié)果 (1∶10供試液)

表2結(jié)果顯示，白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)符合藥典要求，可取1∶10供試液1 mL薄膜法沖洗100 mL進(jìn)行該供試品的霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)通過。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

控制菌采用金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35 ℃培養(yǎng)24 h，后取1∶10供試液10 mL接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中(接入的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌試驗(yàn)菌液各1 mL，其中含菌量≤100 cfu)，混勻，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。取金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，銅綠假單胞菌培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35 ℃培養(yǎng)18 h。結(jié)果見表3、表4。

表3結(jié)果顯示，試驗(yàn)組檢出金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌，該供試品的金黃色葡萄球菌檢查方法適用性試驗(yàn)通過。

表3 金黃色葡萄球菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

表4結(jié)果顯示，試驗(yàn)組檢出銅綠假單胞菌，該供試品的銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗(yàn)通過。

表4 銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

藥品安全控制之一在于對(duì)其進(jìn)行微生物的限度檢查，隨著我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)逐漸接軌，微生物限度檢查方法得到不斷完善，標(biāo)準(zhǔn)不斷提高，在我國(guó)2015版的《中國(guó)藥典》中將“微生物限度檢查方法驗(yàn)證”修改為“方法適用性檢查”，更加準(zhǔn)確以及科學(xué)地反映了微生物限度檢查的特點(diǎn)[5]。前者強(qiáng)調(diào)方法學(xué)的可行性，后者則更加強(qiáng)調(diào)突出試驗(yàn)條件、供試品等多因素整體性系統(tǒng)評(píng)價(jià)[6-7]，微生物限度檢查是系統(tǒng)性的工作，方法適用性試驗(yàn)必不可少[8-9]。

本次試驗(yàn)中需氧菌總數(shù)測(cè)定取本品10 mL，以pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液為稀釋液，制成1∶10供試液，取1∶10供試液1 mL薄膜過濾，每張慮膜用pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液沖洗3次，100 mL/次。按照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：計(jì)數(shù)檢查法(通則1105)”檢查，應(yīng)符合“非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)(通則1107)”規(guī)定。霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定取本品10 mL，以pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液為稀釋液，制成1∶10供試液，取1∶10供試液1 mL薄膜過濾，每張慮膜用pH=7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液沖洗1次，100 mL/次。按照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：計(jì)數(shù)檢查法(通則1105)”檢查，應(yīng)符合“非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)(通則1107)”規(guī)定。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌按照需氧菌總數(shù)測(cè)定方法制備1∶10供試液，取其中的10 mL接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，按照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法(通則1106)”進(jìn)行檢查，并且同時(shí)應(yīng)符合“非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)(通則1107)”中的規(guī)定。

總之，本試驗(yàn)中復(fù)方荊參溶液的需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)、控制菌等檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，可為復(fù)方荊參溶液微生物限度檢查方法的中藥復(fù)方制劑在檢查方法的建立方面提供參考[10]。