荊 鳴，蔡馥伊，姚雪敏，孔 亮，程 嵐，李學(xué)濤

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

乳腺癌是威脅人類生命健康的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，具有轉(zhuǎn)移率高、生存周期短等特點[1]。表阿霉素(Epirubicin，EPI)是一種廣譜高效的抗生素類抗腫瘤藥。作為阿霉素的同分異構(gòu)體，表阿霉素可以直接嵌入DNA的核堿基對之間，阻斷mRNA的轉(zhuǎn)錄過程，干擾DNA和RNA的形成，從而抑制腫瘤細胞的增長。表阿霉素的抗瘤譜較廣，對乳腺癌、卵巢癌、肝癌、軟組織肉瘤等多種惡性腫瘤均有抑制作用。但在臨床使用過程中，表阿霉素的靶向性較弱，常常會導(dǎo)致骨髓抑制、心臟毒性等嚴重的毒副作用[2-3]。五味子乙素(Schisandrin B)是一種從中藥五味子中提取出來的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素。近年來研究表明，五味子乙素可以抑制腫瘤細胞對正常組織的轉(zhuǎn)移和侵襲。脂質(zhì)體是一種由雙分子層膜組成的球形囊泡，脂質(zhì)體的發(fā)現(xiàn)為化療藥物提供了新的靶向載體。利用脂質(zhì)體的親和性、定向性，可增強化療藥物對腫瘤細胞的靶向性，提高腫瘤細胞對化療藥物的攝取量，從而達到提高療效、降低毒副作用的目的[3-4]。細胞穿膜肽PFVYLI(PFV)是由6個氨基酸組成的電中性短肽鏈。研究表明PFV可顯著增強化療藥物穿透腫瘤細胞膜的能力，從而提高體內(nèi)治療效果[5]。本研究采用薄膜水化-硫酸銨梯度法制備PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體，將PFV修飾在脂質(zhì)體的表面，旨在提高該脂質(zhì)體的靶向作用，采用星點設(shè)計-效效應(yīng)面法優(yōu)化脂質(zhì)體的最佳制備工藝，采用HPLC法測定該靶向脂質(zhì)體中的藥物含量，并分別測定PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體對人源乳腺癌細胞MCF-7與MDA-MB-231的細胞毒性作用，為PFV修飾表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體的后續(xù)試驗研究提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52CS，上海亞榮生化儀器廠)；萬分之一天平(FA1004，上海越平科學(xué)儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(B220，上海亞榮生化儀器廠)；高效液相色譜儀與紫外檢測器(LC-2010AHT，日本島津)；Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μmol/L，上海月旭)；超聲波細胞粉碎機(JY92-IIN，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料

表阿霉素(批號：HF070807，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；五味子乙素(批號：201805793湖州展舒生物科技有限公司)；膽固醇與卵磷脂(日本NOF公司)；DSPE-PEG2000-PFV(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗室合成)；人源乳腺癌MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)；DMEM細胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；三氯乙酸和乙酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，批號：1016K022，邁晨科技有限公司)；乙腈、甲醇、乙醇等所用試劑均為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體制備

采用薄膜水化-硫酸銨梯度法制備PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體，分別稱取處方量的磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000-PFV、五味子乙素(摩爾比=120∶15∶1∶4)，置于圓底燒瓶中加甲醇使其充分溶解。隨后，將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于40 ℃的水浴鍋中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至圓底燒瓶中的甲醇全部蒸干，燒瓶底部形成透明的磷脂-膽固醇雙分子層薄膜。加入硫酸銨水溶液5 mL，超聲水化5 min使雙分子層薄膜充分溶解。將混懸液置于細胞粉碎機中破碎10 min，過膜兩次，即得PFV修飾的五味子乙素脂質(zhì)體。將制得的五味子乙素脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移至分子截留量為8 000～14 000Da的透析袋中，并將透析袋放入盛有PBS緩沖鹽水溶液(pH=7.2)的燒杯中透析24 h，每8 h更換1次PBS緩沖鹽水溶液，使其透析充分。取出透析袋中的脂質(zhì)體，加入處方量的表阿霉素，于40 ℃的水浴鍋中震搖20 min使得表阿霉素被脂質(zhì)體充分包載，即得PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體。

2.2 表阿霉素的含量測定及方法學(xué)建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm/L)，流動相：乙腈-0.02 mol/L KH2PO4(0.45%三乙胺)(33∶67，V/V，磷酸調(diào) pH=4.1)，柱溫：30 ℃，檢測波長：254 nm，流速：1 mL/min，進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備 表阿霉素對照品溶液制備：精密稱取表阿霉素對照品10 mg于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度線。超聲溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液備用。

供試品溶液制備：精密稱取PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體2.5 mL于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線。超聲溶解2 min，使得脂質(zhì)體中的藥物充分釋放，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密稱取“2.2.2”項下對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中。分別加入甲醇稀釋至刻度。超聲混勻后精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀中，按照“2.2.1”項下色譜條件，測定其峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。得回歸方程為y=29965x-44416(r=0.997，n=6)。結(jié)果表明，表阿霉素在10～60 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度實驗 按照“2.2.1”項下色譜條件，取同一濃度的表阿霉素標準品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。計算RSD值為0.76%，表明該儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性實驗 按照“2.2.1”項下色譜條件，取PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體6 mL，連續(xù)制備6批供試品溶液。分別進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果得該脂質(zhì)體中表阿霉素的平均含量為0.097 mg/mL，RSD值為1.07%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 按照“2.2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10 h時精密吸取同一供試品溶液10 μL，測定藥物含量，記錄峰面積，得RSD值為0.62%，表明PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 回收率實驗 精密吸取1.25 mL空白脂質(zhì)體于10 mL容量瓶中，加入等體積濃度為100 μg/mL的表阿霉素對照品溶液，加入甲醇溶液，超聲后定容，制成樣品溶液，測定其含量，重復(fù)6次，記錄峰面積。結(jié)果該脂質(zhì)體的平均回收率為99.3%，RSD值為1.05%，符合相關(guān)規(guī)定。

2.2.8 表阿霉素包封率測定 采用濕法裝柱法填充葡聚糖凝膠色譜柱，取Sephadex G-50 2.1 g，采用PBS水溶液浸泡24h使其溶脹，填充進一根底部有篩板的玻璃柱內(nèi)(10 cm×1.5 cm)。精密吸取PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體混懸液0.5 mL，于凝膠色譜柱上方緩慢滴加，PBS溶液洗脫，流速1.0 mL/min。待凝膠色譜柱開始流出紅色乳光溶液時用5 mL的容量瓶收集，直至紅色液體全部流出。隨后，采用PBS水溶液定容至5 mL刻度線，此試樣為過柱后脂質(zhì)體。另取0.5 mL PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體，用PBS溶液定容至5 mL容量瓶中，為過柱前脂質(zhì)體。以下公式用來計算PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體的包封率：表阿霉素包封率(%)=過柱后脂質(zhì)體中表阿霉素的含量/過柱前脂質(zhì)體中表阿霉素的含量×100% 。

2.3 脂質(zhì)體的處方優(yōu)化

采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化脂質(zhì)體的最佳制備處方，根據(jù)單因素考察結(jié)果和參考文獻，以表阿霉素的包封率為考察指標。固定處方量為5 mL，磷脂投藥量為44 mg，表阿霉素與五味子乙素摩爾比為1∶5，分別選擇膽固醇投藥量(A)、表阿霉素投藥量(B)以及水化溫度(C)三個對表阿霉素包封率影響較大的因素作為考察因素，并確定其用量范圍為A：4～12 mg，B：0.2～0.8 mg，C：25～60 ℃。表1與表2為處方優(yōu)化的實驗設(shè)計及結(jié)果。

表2 設(shè)計方案與結(jié)果

表1 因素與水平

利用Design expert v8.0.6.1軟件，對各因素進行多元回歸擬合，擬合方程為包封率Y=97.40+3.55A+9.96B-6.61C-12.40AB+0.35AC+28.38BC-1.89A2-17.46B2-15.96C2(P<0.001，r=0.96)。說明該回歸模型良好，可以對不同處方條件下的脂質(zhì)體包封率進行預(yù)測。該回歸模型的P<0.001，說明其具有顯著性。其中BC、C2對Y有顯著性影響(P<0.01)，C、A2、AC對Y沒有顯著影響(P>0.5)，可以采用該模型優(yōu)選該脂質(zhì)體的最佳制備工藝及處方。

采用Design expert v8.0.6.1軟件生成各因素對包封率影響的三維效應(yīng)面和二維等高線圖，結(jié)果如圖1所示，PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素的最佳制備工藝為膽固醇9.6mg、表阿霉素含量0.48 mg、水化溫度40 ℃，此時脂質(zhì)體的包封率預(yù)測值為99.07%。

圖1 各因素對脂質(zhì)體包封率影響的效應(yīng)面及等高線

2.4 含量測定

根據(jù)星點設(shè)計-效應(yīng)面法確定的最佳制備工藝，根據(jù)“2.1”項下的方法制備3批脂質(zhì)體，采用“2.2.1”項下所示方法測定藥物含量，記錄脂質(zhì)體中表阿霉素的峰面積及含量。結(jié)果見表3。

表3 脂質(zhì)體中藥物含量及包封率測定結(jié)果

經(jīng)計算得，3批脂質(zhì)體中表阿霉素的平均含量為94.28%、89.35%、92.16%，平均包封率為98.21%、93.07%、96.00%，符合相關(guān)規(guī)定。因此確定脂質(zhì)體的最佳制備工藝為處方量為5 mL、磷脂44 mg、膽固醇9.6 mg、表阿霉素0.48 mg、五味子乙素1.77 mg、水化溫度40 ℃。

2.5 細胞毒性評價

為了驗證各組脂質(zhì)體制劑對乳腺癌細胞的殺傷能力，采用SRB法對該脂質(zhì)體的細胞毒性進行考察。取生長狀態(tài)良好的MDA-MB-231與MCF-7乳腺癌細胞，胰酶消化，培養(yǎng)基復(fù)旋，以每孔1.8×104的密度接種在96孔板內(nèi)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，24 h后進行給藥處理。分別給予兩組細胞空白脂質(zhì)體、表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體、PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體，表阿霉素的濃度范圍為0～15 μmol/L(摩爾比∶表阿霉素/五味子乙素= 1∶5)。

給藥48 h后，將細胞板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，倒掉培養(yǎng)液。每孔加入200 mL三氯乙酸溶液(濃度10 g/mL)，4 ℃下固定細胞1 h。隨后，每孔加入100 μmol/L濃度為0.4%的SRB染色液染色20 min，用5%的乙酸溶液清洗掉多余的SRB染色液。隨后，每孔加入200 μL Tris堿溶液。搖床上震搖30 min。于酶標儀540 nm波長下檢測吸光度。細胞存活率用以下公式來計算：

細胞存活率%=(給藥組的吸光度數(shù)值/對照組的吸光度數(shù)值)×100%

每組實驗進行3次，并且針對每個劑量水平測定6次。最后，建立劑量-效應(yīng)曲線，使用GraphPad Prism軟件6.0版計算IC50值。

圖2為細胞毒性曲線與IC50值。實驗結(jié)果表明，腫瘤細胞經(jīng)空白脂質(zhì)體處理后，對細胞存活率影響不大，說明脂質(zhì)體材料安全無毒。五味子乙素與表阿霉素脂質(zhì)體對MDA-MB-231和MCF-7腫瘤細胞的IC50值分別為(4.48±1.12)μmol/L和(3.24±1.09)μmol/L，PFV修飾的五味子乙素與表阿霉素脂質(zhì)體對MDA-MB-231和MCF-7腫瘤細胞的IC50值分別為(1.36±1.14)μmol/L和(1.31±1.52)μmol/L，說明PFV與五味子乙素的加入能夠增強該脂質(zhì)體的細胞毒性作用。

注：A為MDA-MB-231細胞的細胞毒性實驗，B為MCF-7細胞的細胞毒性實驗；A1為 MDA-MB-231細胞生存率，A2為脂質(zhì)體對 MDA-MB-231細胞的IC50值；B1為 MCF-7細胞生存率，B2為脂質(zhì)體對MCF-7細胞的IC50值。

3 討論

乳腺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位于女性惡性腫瘤的前列。目前，化療仍然是主要的治療手段之一。然而，現(xiàn)有化療藥物仍然具有靶向性差、毒副作用強等諸多缺點。因此，迫切需要一種新的給藥系統(tǒng)來提高乳腺癌的治療效果[6]。五味子乙素(Schisandrin B)是中藥北五味子中的主要活性成分。作為化療藥物的中藥輔助劑，五味子乙素能夠表現(xiàn)出較為全面的抗腫瘤活性。首先，五味子乙素可以抑制腫瘤細胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白的外排，從而逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤的多藥耐藥作用[7]；其次，體外實驗表明，五味子乙素能夠降低腫瘤細胞的侵襲能力，降低腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性[8]。不僅如此，五味子乙素能夠阻止心肌纖維化的發(fā)生，是一種低毒性的心血管保護劑，可有效阻止阿霉素等化療藥物引起的慢性心臟毒性作用[9-10]。因此，在本研究中，將五味子乙素與表阿霉素聯(lián)用，預(yù)期能夠提高表阿霉素的抗腫瘤效果。

PFVYLI是一種僅含非極性殘基的疏水性穿膜短肽，位于細胞穿模肽C105Y的C端，是C105Y穿膜性能最強的一部分。將PFVYLI修飾在脂質(zhì)體的表面，能在脂質(zhì)體自身EPR效應(yīng)的基礎(chǔ)上增強其靶向性，使得化療藥物更快速地內(nèi)到達腫瘤細胞內(nèi)部。本研究，構(gòu)造了多功能脂質(zhì)體靶向給藥系統(tǒng)，將PFVYLI修飾在脂質(zhì)體的表面，利用PFVYLI的穿膜性能，提高腫瘤細胞對化療藥物的攝取量，從而解決化療藥物表阿霉素水溶性差、毒副作用強等缺點[11]。當多功能脂質(zhì)體到達腫瘤部位后，表阿霉素與五味子乙素同時釋放，從而達到更快速、更全面的抗腫瘤目的。本研究還進行了細胞毒性試驗，考察了該脂質(zhì)體對MDA-MB-231以及MCF-7兩種人源乳腺癌細胞的毒性作用。結(jié)果表明，PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體對這兩種細胞的細胞毒性作用都遠大于其他兩種脂質(zhì)體，說明在該靶向給藥系統(tǒng)中，PFV及五味子素能夠起到增強細胞毒性的作用。

在脂質(zhì)體的制備工藝中，需要考察多個因素對包封率的影響，并且對結(jié)果進行優(yōu)化。星點設(shè)計-效應(yīng)面法采用線性或非線性方程擬合實驗結(jié)果與影響因素之間的關(guān)系，根據(jù)數(shù)學(xué)模型繪制效應(yīng)面來尋求最佳的制備工藝。與正交設(shè)計和均勻設(shè)計相比，星點設(shè)計-效應(yīng)面具有精密度高、試驗次數(shù)少、數(shù)學(xué)模型擬合的復(fù)相關(guān)系數(shù)較高等優(yōu)點。因此，本研究選擇星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化PFV修飾的表阿霉素與五味子乙素脂質(zhì)體。根據(jù)前期預(yù)實驗的結(jié)果，最終篩選出3個對脂質(zhì)體包封率影響較大的因素進行處方優(yōu)化，最終確定該脂質(zhì)體的最佳制備工藝為處方量5 mL、磷脂44 mg、膽固醇9.6 mg、表阿霉素0.48 mg、五味子乙素1.77 mg、水化溫度40 ℃。經(jīng)驗證該脂質(zhì)體的最終處方平均包封率為99.1%，符合相關(guān)要求。