戴碧鑫，董碧蓮，蔡延渠，朱盛山*

(1.廣州白云山星珠藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510931；2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006)

大黃是廖科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、 唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim，ex Balf.) 或藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根和根莖。大黃味苦、性寒，屬中藥瀉下藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有瀉下、消炎、抗菌、抗病毒、利膽、止血、降血脂、降血壓等藥理作用[1-2]。中藥渣是指中藥材經(jīng)一定的加工方法提取有效成分后的殘留物[3-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國 90%以上的生產(chǎn)廠家將藥渣作為廢料垃圾，年廢棄量達(dá)數(shù)十萬噸，對藥渣采取堆、焚燒和掩埋等方式不僅會導(dǎo)致環(huán)境污染，也會造成中藥渣資源的極大浪費(fèi)[4-5]。有文獻(xiàn)[5]表明，中藥經(jīng)提取后，其活性成分約剩余30%殘留在藥渣中。大黃中蒽醌為其主要活性成分，其含有的蒽醌物質(zhì)包括蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚[6-7]。為此，筆者對大黃及其提取藥渣中的總蒽醌含量及體外抗菌活性進(jìn)行測定，旨在為大黃藥渣的后期研究利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜；BP211D電子天平(Sartorius)；甲醇為色譜純(麥克林)；乙醇為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；超純水(屈臣氏蒸餾水)；蘆薈大黃素(批號：T28D6F8264)、大黃酸(批號：T30A8F42628)、大黃素(批號：C18F8Q29652)、大黃素甲醚(批號：T18O10F100404)，純度≥98%，均購于上源葉生物科技有限公司；大黃酚(批號：C10718598，麥克林)；大黃(批號：F1906037)、大黃藥渣1(批號：F1906015，為水提藥渣)、大黃藥渣2(批號：F1906006，為50%醇提藥渣)由廣州白云山星珠藥業(yè)有限公司提供。

1.2 菌株

本實(shí)驗(yàn)使用的菌株具體信息如表1所示。

表1 菌株信息

1.3 樣品

1.3.1 對照品溶液制備 精密稱取大黃素8.62 mg、大黃酸7.90 mg、蘆薈大黃素8.46 mg、大黃酚8.32 mg，將其混合，大黃素甲醚4.14 mg，分別加甲醇稀釋至每1 mL含大黃素34.48 μg、大黃酸31.6 μg、蘆薈大黃素33.84 μg、大黃酚32.8 μg的混合液及含大黃素甲醚17.64 μg的對照品溶液。分別精密量取上述對照品溶液各1 mL混勻，即得每 l mL中含大黃素17.24 μg、大黃酸15.8 μg、蘆薈大黃素16.92 μg、大黃酚16.4 μg大黃素甲醚8.28 μg的混合液。

1.3.2 供試品溶液制備 稱取過40目篩的大黃原藥材、藥渣1、藥渣2粉末各50 g，分別用10倍量50%乙醇回流提取2次，每次1 h，提取液抽濾后60 ℃減壓濃縮成1 g/mL的浸膏。吸取1 mL浸膏至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，0.22 μm濾膜濾過即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃含量測定

2.1.1 色譜條件 采用 Welchrom C18色譜柱(4.6 mm×300 mm，5 μm)，流動相為甲醇- 0.1%磷酸水(85∶15)，檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL /min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。按照上述條件進(jìn)樣，對照品及供試品各組分分離度良好，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖2 供試品色譜

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取“1.3.1”項(xiàng)下對照品液分別進(jìn)樣2.5、5、10、15、20 μL，進(jìn)樣量及峰面積見表2。以對照品峰面積為縱坐標(biāo)，樣品含量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，回歸方程結(jié)果見表3。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別在42.3～338.4 ng、39.5～316 ng、43.1～334.8 ng、41～328 ng、20.7～165.6 ng進(jìn)樣量范圍內(nèi)與其峰面積積分具有良好的線性關(guān)系。

表3 對照品回歸方程

圖3 對照品含量-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 對照品進(jìn)樣量及峰面積

2.1.3 精密度考察 取“1.3.1”項(xiàng)下對照品溶液，于“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次測定，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.37%、0.38%、0.03%、0.11%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性考察 取“1.3.1”項(xiàng)下對照品液，室溫下放置0、2、4、8、24 h后，于“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.09%、0.27%、0.18%、0.19%、0.14%，說明溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，不影響含量測定。

2.1.5 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品3份，分別加入一定量的對照品溶液，按照測定方法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，平均回收率為99.6%，RSD=0.25%。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn) (n=3)

2.1.6 大黃蒽醌含量測定 取“1.3.2”項(xiàng)下樣品液，于“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，每個(gè)樣品平行3次操作，結(jié)果見表5。大黃藥渣1為10倍量水回流提取2次，1 h/次，提取后經(jīng)烘干而得的藥渣，大黃藥渣2為10倍量50%乙醇回流提取2次，1 h/次，經(jīng)烘干后的藥渣。通過測定得大黃原藥材、大黃藥渣1、大黃藥渣2的總蒽醌含量分別為1.014 416 mg·g-1、0.710 85 mg·g-1、0.338 91 mg·g-1，其中藥渣1、藥渣2未被提取的總蒽醌分別高達(dá)70.07%、33.41%。

2.2 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 菌種活化和菌懸液制備 將冷藏保存的菌種在瓊脂板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行復(fù)蘇，用生理鹽水將菌洗下得菌懸液，采用麥?zhǔn)媳葷岱ǖ?×106CFU/mL的菌懸液。

2.2.2 最低抑菌濃度(MIC)測定 采用二倍稀釋法，按無菌操作吸取藥液和菌懸液各100 μL于96孔板第1孔至第11孔中，第12孔加入配制溶劑和菌懸液各100 μL作為陰性對照。96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)20 h，觀察藥物最低濃度孔無細(xì)菌生長者，即為該試菌MIC值，結(jié)果見表5。

表5 總蒽醌的含量測定 (mg·g-1，n=3)

表5 體外抗菌結(jié)果 (mg/mL)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃經(jīng)水提和50%乙醇提取后藥渣中的總蒽醌含量及MIC值相差較大，藥渣1、藥渣2中未被提取的總蒽醌含量分別高達(dá)70.07%、33.41%，50%乙醇較水對大黃總蒽醌有更高的提取效率，以總蒽醌含量為指標(biāo)來看，經(jīng)水提取后的藥渣1仍有很好的利用價(jià)值。同種藥材對不同的菌株抗菌效果不同，大黃原藥材對8種實(shí)驗(yàn)菌均有較好的抗菌作用，尤其是對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌、臨床耐藥菌及鮑曼不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌、臨床耐藥菌抑菌效果較好，其MIC值分別為15.6、3.9、3.9、7.8 mg/mL，并且對金黃色葡萄球菌臨床耐藥菌、鮑曼不動桿菌臨床耐藥菌的抑菌效果均強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株；大黃水提藥渣1對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌、臨床耐藥菌及鮑曼不動桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌、臨床耐藥菌抑菌效果較好，其MIC值分別為31.25、7.8、15.6、15.6 mg/mL，并且對金黃色葡萄球菌臨床耐藥菌的抑菌效果強(qiáng)于其標(biāo)準(zhǔn)菌株，對鮑曼不動桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床耐藥菌的抑菌作用相同；大黃50%醇提藥渣對實(shí)驗(yàn)菌株的MIC值均>125 mg/mL，抑菌效果差。

綜上所述，以總蒽醌含量及MIC值作為評價(jià)指標(biāo)，大黃水提藥渣1仍有很好的利用價(jià)值，而50%乙醇提藥渣2利用價(jià)值較差。