錢越，劉佳，李智，周磊，戴紅良

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院；2.遼寧鐵道職業(yè)技術(shù)學(xué)院；3.錦州醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院；4.錦州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

胃癌(gastric cancer，GC)是全世界最常見的癌癥之一，盡管20世紀(jì)中的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)有所下降，但其仍然是威脅人類生命的主要病癥，同時也是東亞地區(qū)最常見的癌癥。二甲雙胍作為一種上市已久的“老藥”近年來被證明在降低癌癥發(fā)病率和死亡率方面發(fā)揮出了積極作用，將其作為一種輔助抗癌藥物非?？尚衃1-2]。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，可以用于治療多種腫瘤疾病，包括乳腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌等。作為一種治療晚期肝癌的一線用藥，索拉非尼可以通過阻斷Raf/MEK/ERK信號通路達(dá)到治療效果[3]。由于抗腫瘤藥物毒副作用較大，使得腫瘤的治療步履維艱，特別是單一藥物治療由于藥物劑量較大等原因使很多患者難于忍受。因此聯(lián)合使用其他藥物，在起到良好治療效果的同時減少抗腫瘤藥物的用量，成為了科研工作者的研究目標(biāo)。有文獻(xiàn)報道，索拉非尼聯(lián)合二甲雙胍具有一定的聯(lián)合抗腫瘤作用[4]，對肝癌有良好的治療作用[5]，但對于胃癌的治療抑制作用則少有報導(dǎo)，本文以胃癌細(xì)胞HGC-27為研究對象探討索拉非尼聯(lián)合二甲雙胍后對胃癌細(xì)胞的抑制作用，為胃癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Thermo Fisher Scientific公司)，二甲基亞砜、噻唑藍(lán)、結(jié)晶紫、p-ERK1/2(WLP1512)抗體、ERK1/2(WL01864)抗體，Bax(WL01637)抗體，Bcl-2(WL03790)抗體(萬類生物科技有限公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Santa Cruz公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)，倒置顯微鏡(德國LEICA)，超凈工作臺(美國Thermo Fisher Scientific公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)青霉素-鏈霉素溶液(100×)，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液(北京索萊寶科技有限公司)，胃癌HGC-27細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫。索拉非尼(純度98.5%)購自湖北興銀河化工有限公司，二甲雙胍(純度99%)購自菏澤巨和實(shí)業(yè)有限公司，凋亡試劑盒(WLA001a)購自萬類生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組情況

對照組為不加藥物組，同時加入0.01% DMSO消除差異因素；索拉非尼單藥組藥物濃度為0、2、5、10 μmol/L，二甲雙胍單藥組藥物濃度為0、2、5、10 mmol/L，索拉非尼在5 μmol/L，二甲雙胍在10 mmol/L細(xì)胞活力差異開始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)索拉非尼聯(lián)合二甲雙胍藥物濃度設(shè)置為5 μmol/L(索拉非尼)，10 mmol/L(二甲雙胍)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞以含10%胎牛血清和1%的青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。0.25% EDTA胰酶消化傳代，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測

將對數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，按照上述實(shí)驗(yàn)分組給藥接著培養(yǎng)48 h。藥物作用結(jié)束后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后以150 μL DMSO充分溶解甲臜后，在570 nm波長下測定每孔吸光度值。

1.2.4 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

將HGC-27細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1000個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后，按照上述實(shí)驗(yàn)分組給藥繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，以形成集落肉眼較為明顯為依據(jù)，觀察細(xì)胞集落大小終止實(shí)驗(yàn)，隨后棄去培養(yǎng)液并用PBS輕洗3遍，4%多聚甲醛固定后用結(jié)晶紫染色并拍照。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將HGC-27細(xì)胞接種于6孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組給藥，培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶懸浮細(xì)胞，收集并用PBS洗滌，取105個細(xì)胞用binding buffer重懸，加入凋亡試劑盒中PI及Annexin V-FITC避光孵育10 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 蛋白提取和免疫印跡

取對數(shù)期生長的細(xì)胞按照上述實(shí)驗(yàn)分組給藥，藥物作用48 h收集細(xì)胞，加入含0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。蛋白經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。以新鮮配置5% BSA室溫下封閉1 h，TBST洗膜后，加入用TBST稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。用TBST充分洗去非特異結(jié)合的抗體后，室溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h。TBST充分洗滌后，ECL顯色后經(jīng)凝膠成像儀成像分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置，分別用ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2、GAPDH作為一抗進(jìn)行孵育，檢測各個指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 索拉非尼，二甲雙胍及聯(lián)合用藥對HGC-27細(xì)胞活力的影響

MTT結(jié)果顯示，不同濃度索拉非尼(0、2、5、10 μmol/L)及二甲雙胍(0、2、5、10 mmol/L)隨著劑量增加，均可對胃癌HGC-27細(xì)胞起到一定的抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴性，索拉非尼在5 μmol/L，二甲雙胍在10 mmol/L細(xì)胞活力差異開始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖1。因此選取該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中索拉菲尼IC50=8.299 μmol/L，二甲雙胍IC50=18.973 mmol/L。

a:與對照組相比P<0.05

索拉非尼，二甲雙胍及索拉非尼聯(lián)合二甲雙胍處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力在單藥作用下有所降低，聯(lián)合用藥細(xì)胞活力得到更顯著抑制，見圖2。細(xì)胞的抑制率按如下公式計(jì)算：抑制率 = 1-(加藥組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。利用金氏公式判斷兩藥的聯(lián)合效應(yīng)：Q = E(A+B)/ [EA+(1-EA)×EB]，其中，E(A+B)為兩藥合用的抑制率，EA、EB為兩藥單獨(dú)應(yīng)用的抑制率，Q在0.85～1.15之間代表兩藥具有相加效應(yīng)；Q >1.15代表兩藥具有協(xié)同效應(yīng)；Q <0.85代表兩藥具有拮抗作用[6]。二甲雙胍聯(lián)合索拉非尼對HGC-27細(xì)胞的抑制率顯著高于單藥組并且Q = E(A+B) / [EA+(1-EA)×EB] = 0.67 / [0.19+(1-0.19)×0.44] = 1.23，兩藥具有協(xié)同增效的作用，見表1。

表1 單藥及二甲雙胍聯(lián)合索拉非尼對HGC-27細(xì)胞的抑制作用

a:與對照組相比P<0.05；ab:與met組和sor組相比，P均<0.05

2.2 索拉非尼，二甲雙胍及聯(lián)合用藥對HGC-27細(xì)胞集落形成的影響

集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，10 mmol/L二甲雙胍及5 μmol/L索拉非尼均能起到抑制HGC-27細(xì)胞集落生長的作用，聯(lián)合用藥集落基本不再形成，見圖3。

2.3 索拉非尼，二甲雙胍及聯(lián)合用藥對HGC-27細(xì)胞形態(tài)的影響

不加藥物時細(xì)胞生長狀態(tài)良好，增殖旺盛，細(xì)胞圓潤明亮，細(xì)胞膜輪廓明顯，單藥索拉非尼或單藥二甲雙胍作用下細(xì)胞生長受到一定程度的抑制，生長較慢，聯(lián)合用藥后細(xì)胞生長受到明顯抑制，細(xì)胞呈現(xiàn)碎片狀，見圖4。

a:與對照組相比P<0.05；ab:與met組和sor組相比，P均<0.05

圖4 索拉菲尼，二甲雙胍及聯(lián)合用藥對HGC-27細(xì)胞形態(tài)影響

2.4 索拉非尼，二甲雙胍及聯(lián)合用藥對HGC-27細(xì)胞凋亡的影響

對照組細(xì)胞的早期凋亡率為2.93%，晚期凋亡率為3.05%，二甲雙胍治療組早期凋亡率為6.68%，晚期凋亡率為7.58%，索拉非尼治療組早期凋亡率為10.3%，晚期凋亡率為6.1%，聯(lián)合用藥組早期凋亡率為14.4%，晚期凋亡率為6.35%，見圖5。

圖5 索拉菲尼，二甲雙胍及聯(lián)合用藥對HGC-27細(xì)胞凋亡的影響

2.5 Western blot 檢測ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

與對照組相比，索拉非尼單藥組，二甲雙胍單藥組，聯(lián)合用藥均能降低p-ERK的表達(dá)，聯(lián)合用藥可以降低ERK的表達(dá)，索拉非尼單藥和聯(lián)合用藥可以升高Bax表達(dá)，3組均能降低Bcl-2的表達(dá)，對以上蛋白的調(diào)控，聯(lián)合用藥表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用，見圖6。

a:與對照組相比P<0.05；ab:與met組和sor組相比，P均<0.05；ac:與sor組相比P<0.05

3 討 論

二甲雙胍是一種具有吸引力的抗癌藥物，因?yàn)槠渚哂辛己玫陌踩涗浐惋@著藥效，而且二甲雙胍作為一種仿制藥成本低廉。在過去的10年中，對二甲雙胍抗腫瘤活性的研究熱度逐年上升，流行病學(xué)、臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相結(jié)合，支持二甲雙胍的潛在抗癌作用，本實(shí)驗(yàn)中10 mmol/L的二甲雙胍已經(jīng)顯現(xiàn)抗腫瘤活性但是效果并不顯著。索拉非尼是一種口服多激酶抑制劑，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。它于2006年被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌，并于2007年作為晚期肝細(xì)胞癌(HCC)的獨(dú)特靶向藥物，還可治療甲狀腺癌等多種癌癥[7]，雖然索拉非尼可顯著延長患者的生存時間，但它有嚴(yán)重的不良副作用包括胃腸道不良反應(yīng)、高血壓、厭食、脫發(fā)等[8]并且經(jīng)常發(fā)生耐藥性，因此，探索索拉非尼耐藥機(jī)制并制定個體化治療策略以應(yīng)對這些問題具有重要意義，聯(lián)合用藥可以有效減小劑量和毒副作用不失為一種新的治療策略。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)是參與正常細(xì)胞增殖，存活和分化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)途徑，人類三分之一的腫瘤涉及MAPK/ERK信號傳導(dǎo)失調(diào)，這也成為開發(fā)抗癌藥物有吸引力的靶標(biāo)。ERK1/2可能是克服RAF-MEK-ERK途徑中獲得性耐藥的最佳靶點(diǎn)，因此可以看出其在腫瘤治療中的重要地位。很多腫瘤進(jìn)程與ERK通路活化相關(guān)[9]，也有報道某些藥物通過ERK的活化增強(qiáng)藥物敏感性[10]，或是通過抑制ERK信號通路的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤活性[11]。

Bax蛋白可促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，但這種作用機(jī)制不是自身直接發(fā)揮作用，Bax蛋白的過表達(dá)會啟動凋亡信號通路，Bax調(diào)節(jié)凋亡的主要機(jī)制是Bax蛋白對Bcl-2蛋白有抑制作用，Bax蛋白是Bcl-2蛋白抑制因子中重要的一個，當(dāng)Bax蛋白的占優(yōu)勢時，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bcl-2蛋白占優(yōu)勢時，就會抑制細(xì)胞的凋亡，Bax抑制Bcl-2的功能主要通過它的BH1區(qū)和BH2區(qū)以及與它對應(yīng)的Bcl-2蛋白形成異二聚體。因此，Bax和Bcl-2表達(dá)水平之間的平衡對細(xì)胞存活和死亡都很重要。

本研究通過MTT、集落形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)3方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了索拉非尼、二甲雙胍及聯(lián)合用藥對HGC-27細(xì)胞的抑制作用，其效果并不是1加1等于2而是大于2，但是其作用機(jī)制尚不明確，為進(jìn)一步了解其作用的分子機(jī)制，我們用應(yīng)用western blot分別檢查了索拉非尼、二甲雙胍及聯(lián)合用藥作用后ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，索拉非尼單藥組、二甲雙胍單藥組，聯(lián)合用藥均能降低p-ERK的表達(dá)，索拉非尼單藥和聯(lián)合用藥可以降低ERK的表達(dá)，索拉非尼單藥和聯(lián)合用藥可以升高Bax表達(dá)，3組均能降低Bcl-2的表達(dá)，對以上蛋白的調(diào)控，聯(lián)合用藥表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用，由此我們可以看出3種治療方案均能升高Bax/Bcl-2比例，聯(lián)合用藥升高比例更高，通過調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。3種治療方案還可以降低p-ERK表達(dá)，通過抑制ERK活化抑制腫瘤細(xì)胞增殖，同時聯(lián)合用藥在較小用量情況下起到顯著抑制胃癌HGC-27細(xì)胞增殖的作用，減少了大劑量化療藥物的副作用。以上研究我們可以看出索拉非尼聯(lián)合二甲雙胍在索拉非尼的使用劑量不大的情況下，顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，為胃癌的治療及二甲雙胍的臨床應(yīng)用提供新思路。本研究基于ERK信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)研究索拉非尼聯(lián)合二甲雙胍對胃癌HGC-27細(xì)胞的抑制作用，但其對ERK的上游分子和底物的具體作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。