安輝，應(yīng)秀東，方晶，梁春光

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

壓瘡(pressure ulcer，PU)是由于機體突出部位組織受到持續(xù)性壓力導(dǎo)致局部組織長期持續(xù)血流障礙，致使組織發(fā)生缺血、缺氧性潰爛壞死，現(xiàn)已成為長期臥床或癱瘓患者常見并發(fā)癥[1]。壓瘡一旦發(fā)生，病程常遷延，并伴多種并發(fā)癥出現(xiàn)，甚至引發(fā)嚴(yán)重的繼發(fā)感染而導(dǎo)致患者死亡[2]。目前，壓瘡的臨床治療多采用西醫(yī)的局部換藥法，效果不理想，特別對于重癥壓瘡患者，單純換西藥對創(chuàng)面的愈合效果不佳。促進(jìn)創(chuàng)面局部血管重建及粘膜再生，改善創(chuàng)面微循環(huán)，提高抗感染能力是壓瘡治療的重要因素。

研究表明多酚具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗微生物、抗氧化和抗癌等多種生物學(xué)活性，尤其在預(yù)防和治療炎癥性疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景[3]。多酚來源于植物，有8000多種，以糖苷酯或游離糖苷的形式存在[4]。中藥成分黃芩苷屬于多酚家族中的一員，是從黃芩干燥根中提取出來的黃酮類活性成分，具有抗炎，抗氧化和抗過敏特性[5]。黃芩苷在體外和體內(nèi)均能抑制Th17細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞之間平衡，可能是治療Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病的治療劑。課題組前期結(jié)果顯示Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子參與壓瘡損傷過程[6]，拮抗Th17細(xì)胞的治療方案成為壓瘡治療的新思路。本研究通過觀察黃芩苷對壓瘡大鼠模型的干預(yù)效果，進(jìn)一步探討其對Th17/Treg細(xì)胞亞群失衡的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠40只、雄性、12～14 w、體質(zhì)量(200±20) g，購自北京維通利華公司。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，飼料及墊料購自北京維通利華公司。

1.2 主要試劑

黃芩苷(純度> 98%)購自北京生物制品研究所(批號201811126)；貝復(fù)濟購自珠海億勝生物制藥有限公司(批號20180427)HE染色試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號20190128)；RNA提取及SYBRRT-PCR試劑盒購自德國Qiagen公司(Cat No 52904)；RORγt、Foxp3、IL-17及β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司(Cat No ab11177，ab215206，ab79056，ab8226)；FITC-CD4、Percp-IL-17、Percp-CD25及BV421-Foxp3購自美國BD公司(Cat No 340043、565866、551071、562996)；細(xì)胞破膜劑/緩沖液購自美國BD公司(Cat No 554715)：Brefeldin A購自美國BD公司(Cat No 555029)。TUNEL試劑盒、蛋白marker、loading buffer、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司(批號20180216、20190308、20181229、20190425、20180923)；圓形金屬磁盤(直徑25 mm，厚3 mm)、圓環(huán)形鐵盤(內(nèi)徑8 mm，外徑25 mm，厚1 mm)由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研中心提供。

1.3 建立大鼠壓瘡模型

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機將大鼠分為模型對照組(A組)、黃芩苷預(yù)防性用藥組(B組)、黃芩苷治療性用藥(C組)和陽性對照組(D組)，每組10只。B組于壓瘡造模前給予預(yù)防性給藥，黃芩苷(100 mg/kg)腹腔注射，每天兩次，連續(xù)14 d。造模前4組大鼠禁食8 h，給予10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)，沿背部正中線備皮，縱向切口深至筋膜，用鑷子鈍性分離，將圓環(huán)形鐵盤植入大鼠背部皮下組織，縫合筋膜和皮膚層。體外用圓形金屬磁盤吸引體內(nèi)鐵盤產(chǎn)生持續(xù)壓力，使大鼠皮膚局部缺血。缺血2 h后，取下體外磁盤，使血液恢復(fù)灌注30 min，此為1個實驗周期，每天做5個周期，連續(xù)3 d后取出體內(nèi)鐵盤。腹腔給予葡萄糖-鹽水溶液(2.5 h/3 mL)確保體內(nèi)水和電解質(zhì)平衡。模型構(gòu)建成功后，各組壓瘡大鼠給予不同的處理，在處理前均給予生理鹽水清創(chuàng)和碘伏消毒。A組：腹腔注射等體積PBS，每天兩次，連續(xù)14 d；B組：無需處理；C組：黃芩苷(100 mg/kg)腹腔注射，每天兩次，連續(xù)14 d。D組：創(chuàng)面均勻噴灑貝復(fù)濟，再以無菌紗布包扎。4組每天換無菌紗布1次，并觀察潰瘍面局部愈合情況。連續(xù)治療14 d后取材檢測指標(biāo)。其中6只大鼠在實驗過程中死亡：A組在造模后第3、4天因傷口感染死亡3只、B組在造模后第4天死亡2只，C組在造模后第3天死亡1只。

1.4 局部變化

創(chuàng)面紅腫、水泡、滲出、潰瘍和壞死五項分4個等級分?jǐn)?shù)。0分：無變化，用“-”表示；1分：輕度變化，用“+”表示；2分：中度變化，用“++”表示；3分：重度變化，用“+++”表示。

1.5 標(biāo)本采集

大鼠創(chuàng)面處取材，用于HE、TUNEL、組化染色(4%多聚甲醛，4 ℃)、qPCR(-80 ℃)Western blot(-80 ℃)；開腹腔取脾臟，放入含預(yù)冷PBS平皿中備用，后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.6 HE染色

大鼠創(chuàng)面皮膚及皮下肌肉分別用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后封片并鏡檢。

1.7 TUNEL染色

石蠟切片脫蠟至水；修復(fù)：蛋白酶K覆蓋組織，37 ℃ 25 min，洗滌3次，每次5 min；破膜：滴加破膜工作液，常溫20 min，洗滌3次，每次5 min；加試劑TdT和dUTP混合液：按1∶9混合，覆蓋組織，37 ℃ 2 h；BSA封閉；加一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過夜；加二抗，避光室溫50 min；DAPI復(fù)染細(xì)胞核；封片；ipwin32分析結(jié)果。

1.8 qPCR檢測EGF、VEGF、IL-17、IL-6、TGF-β和IL-10mRNA水平

創(chuàng)面組織用Qiagen勻漿器均質(zhì)，4 ℃ 12 000rpm離心15 min，取上清200 μL提取總RNA后進(jìn)行一步法qPCR檢測。反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s；95 ℃ 15 s，50 ℃ 60 s 40個循環(huán)；72 ℃繪制熔解曲線。2-ΔΔCT計算mRNA相對表達(dá)量，見表1。

表1 引物序列

1.9 Western blot檢測

RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)創(chuàng)面組織勻漿后加入裂解液，12 000 rpm離心，BCA蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。加入10 μL樣品，80 V電泳20 min后，調(diào)電壓至110 V，繼續(xù)電泳20～30 min。120 mA 2 h轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h。加一抗稀釋液RORγt(1∶1000)/ Foxp3(1∶1500)/β-actin(1∶2000)，4 ℃搖床過夜。TBST洗滌，加1∶10 000稀釋的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。電化學(xué)ECL發(fā)光，ImageJ分析條帶。

1.10 FCM檢測Th17和Treg細(xì)胞

研磨脾臟，用預(yù)冷PBS重懸脾細(xì)胞并用200目尼龍篩網(wǎng)過濾至離心管中，離心棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，5 min后用10 mL PBS終止，離心棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，分裝于EP管中1毫升/管。加1640培養(yǎng)基1毫升/管，離心后棄上清，每管加1640培養(yǎng)基200 μL，PMA 2 μL和Ionomycin 2 μL，混勻后培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)1 h，加BFA 1微升/管，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，PBS洗滌后離心。Th17細(xì)胞染色：加FITC- CD4 1微升/管，4 ℃ 30 min，PBS洗滌，離心后棄上清，加破膜液100微升/管，4 ℃ 30 min；Perm wash buffer洗滌，離心后棄上清，加Percp-IL-172微升/管，4 ℃ 30 min。Treg細(xì)胞染色：加FITC- CD4和Percp-CD25 1微升/管，4 ℃ 30 min，PBS洗滌，離心后棄上清，加破膜液100微升/管，4 ℃ 30 min；Perm wash buffer洗滌，離心后棄上清，加BV421-Foxp3 2微升/管，4 ℃ 30 min。兩種細(xì)胞染色后均用Perm wash buffer洗滌，離心后棄上清，buffer重懸細(xì)胞，用300目尼龍篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面情況評分

對大鼠創(chuàng)面五種情況評分進(jìn)行方差分析，組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型對照組相比，黃芩苷預(yù)防和治療性用藥組創(chuàng)面紅腫、水泡、滲出、潰瘍和壞死情況有不同程度的好轉(zhuǎn)(P<0.05)；陽性對照組創(chuàng)面紅腫、水泡、滲出、潰瘍和壞死評分較比模型對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.2 HE染色結(jié)果

模型對照組鱗狀上皮層次不清，毛囊數(shù)量減少且結(jié)構(gòu)模糊，皮下組織炎性細(xì)胞浸潤明顯；肌纖維排列紊亂且斷裂明顯，肌橫紋不清晰，間質(zhì)變寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤。黃芩苷預(yù)防性和治療性用藥組毛囊結(jié)構(gòu)較清晰，皮下組織有部分炎性細(xì)胞浸潤；黃芩苷預(yù)防性用藥組較治療性用藥組肌纖維增生及炎性細(xì)胞浸潤情況明顯，有少量肌纖維斷裂。陽性對照組真皮層內(nèi)毛囊數(shù)量多且清晰，少量炎性細(xì)胞浸潤；肌纖維緊密排列，橫紋較清晰，見圖1、圖2。

表2 大鼠創(chuàng)面情況評分

ABCD

ABCD

2.3 TUNEL法檢測創(chuàng)面細(xì)胞凋亡

與模型對照組比較，黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組和陽性對照組創(chuàng)面細(xì)胞凋亡熒光強度明顯降低(P<0.01)。且黃芩苷治療性用藥組下降的幅度高于預(yù)防性用藥組，見表3、圖3、圖4。

ABCD

A：模型對照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽性對照組

圖3 大鼠壓瘡組織TUNEL染色(200倍)

表3 大鼠壓瘡組織TUNEL熒光強度值

2.4 EGF、VEGF、IL-17、IL-6、TGF-β和IL-10 mRNA水平

黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組創(chuàng)面組織EGF、VEGF、TGF-β和IL-10 mRNA水平較比模型對照組有不同程度的升高(P<0.05)，而陽性對照組各因子明顯高于模型對照組(P<0.01)。與模型對照組比較，黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組IL-17和IL-6水平有降低趨勢(P<0.05)，陽性對照組水平顯著降低(P<0.01)。黃芩苷治療性用藥組各因子變化幅度均高于黃芩苷預(yù)防性用藥組(P<0.05)，見表4、圖5。

A：模型對照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽性對照組；B與A組比較，a代表P<0.01；C與A組比較，b代表P<0.01；D組與A組比較，c代表P<0.01；B與C組比較，d代表P<0.05

表4 創(chuàng)面組織EGF、VEGF、IL-17、IL-6、TGF-β和IL-10 mRNA相對表達(dá)量

A：模型對照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽性對照組；B與A組比較，a代表P<0.05，b代表P<0.01；C與A組比較，c代表P<0.01；D組與A組比較，d代表P<0.01；B與C組比較，e代表P<0.05，f代表P<0.01

2.5 RORγt及Foxp3蛋白表達(dá)

與模型對照組比較，黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組RORγt蛋白表達(dá)呈降低趨勢(P<0.05)，陽性對照組顯著降低(P<0.01)。黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥和陽性對照組Foxp3蛋白表達(dá)較比模型對照組有小幅增加(P>0.05)，見表5、圖6、圖7。

A：模型對照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽性對照組

表5 RORγt及Foxp3蛋白相對表達(dá)

A：模型對照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽性對照組；B與A組比較，a代表P<0.05；C與A組比較，b代表P<0.01；D組與A組比較，c代表P<0.01；B與C組比較，d代表P<0.01

2.6 Th17和Treg細(xì)胞比例

與模型對照組比較，黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組和陽性對照組脾臟Th17細(xì)胞比例呈下降趨勢(P<0.01)，Treg細(xì)胞比例有小幅上升(P>0.05)，黃芩苷治療性用藥組Th17比例降低幅度高于預(yù)防用藥組(P<0.05)，見表6、圖8、圖9。

表6 大鼠脾臟Th17和Treg細(xì)胞比例

圖8 大鼠脾臟Th17和Treg細(xì)胞流式圖

A：模型對照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽性對照組；B與A組比較，a代表P<0.05；C與A組比較，b代表P<0.01；D組與A組比較，c代表P<0.01；B與C組比較，d代表P<0.05

3 討 論

CD4+T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞，初始CD4+T在不同的細(xì)胞因子刺激下分化為輔助性T細(xì)胞1(T helper cells，Th)、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)和輔助性濾泡T細(xì)胞(Follicular T helper cells，Tfh)[7]。CD4+T細(xì)胞各亞群具有不同的免疫學(xué)功能，其中Th17細(xì)胞為“促炎性細(xì)胞”，主要誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，而Treg細(xì)胞為“抑炎細(xì)胞”，負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能，主要介導(dǎo)免疫耐受[8]。二者相互拮抗、彼此制約，維持Th17/Treg細(xì)胞亞群平衡有利于機體處于穩(wěn)定狀態(tài)。一旦失衡會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如自身免疫性疾病、慢性炎性感染、哮喘和惡性腫瘤[9-10]。本課題前期實驗發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子參與壓瘡損傷，CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，介導(dǎo)炎癥損傷[6]1857-1861。在此基礎(chǔ)上，本研究通過觀察黃芩苷對壓瘡大鼠模型的干預(yù)效果，進(jìn)一步探討其對Th17/Treg細(xì)胞亞群失衡的調(diào)節(jié)作用。

本實驗結(jié)果顯示黃芩苷預(yù)防性和治療性用藥均能有效改善壓瘡創(chuàng)面滲出、水泡、紅腫和潰瘍等情況，一定程度上修復(fù)毛囊結(jié)構(gòu)，減少皮下組織炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)肌纖維再生，使肌纖維排列較緊密。給予黃芩苷治療2 w后創(chuàng)面表皮生長因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平較比模型組明顯增加。EGF和VEGF 是表皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性多功能細(xì)胞因子，促進(jìn)表皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖再生和基質(zhì)細(xì)胞生長[11-12]。由此可見，黃芩苷通過促進(jìn)EGF和VEGF表達(dá)，改善創(chuàng)面微血管環(huán)境，加強表皮、內(nèi)皮細(xì)胞及纖維組織再生，誘導(dǎo)創(chuàng)面愈合。

黃芩苷不同時間點用藥均能降低壓瘡局部IL-17和IL-6mRNA水平，并提高TGF-β和IL-10水平。IL-6是誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，分化后并產(chǎn)生特異性IL-17，但Th17細(xì)胞可被高濃度TGF-β抑制；高水平TGF-β促進(jìn)Treg分化，并產(chǎn)生抑制因子IL-10[13]?？梢姡S芩苷抑制初始CD4+T細(xì)胞向“促炎性細(xì)胞”Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)其向“抑炎細(xì)胞”Treg分化，進(jìn)而減少壓瘡局部的炎癥損傷。為了進(jìn)一步證實此觀點，對影響Th17和Treg細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子RORγt及Foxp3進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷降低RORγt蛋白表達(dá)，并同時小幅增加Foxp3表達(dá)，提示黃芩苷下調(diào)RORγt以抑制Th17細(xì)胞分化，減少炎癥因子IL-6和IL-17的分泌，同時小幅上調(diào)Foxp3表達(dá)以促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，有利于Th17/Treg恢復(fù)平衡狀態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，黃芩苷降低大鼠脾臟Th17細(xì)胞比例，進(jìn)一步證實細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果，提示Th17/Treg亞群平衡在壓瘡模型中發(fā)揮重要作用，壓瘡引起Th17細(xì)胞介導(dǎo)創(chuàng)面炎癥損傷，抑制Treg細(xì)胞發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，限制Treg對Th17介導(dǎo)的過度免疫應(yīng)答。黃芩苷作為多酚類活性介質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過誘導(dǎo)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例，誘導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞亞群恢復(fù)平衡。Sun F等[14]報道黃芩苷能抑制小鼠Th17細(xì)胞分化，減輕小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。黃芩苷可通過活化芳基烴受體來調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡改善實驗性自身免疫性葡萄膜炎[15]。本研究結(jié)果顯示黃芩苷治療性用藥的干預(yù)效果要高于預(yù)防性用藥，提示黃芩苷對于慢性炎癥性疾病更適合于作為治療性藥物或佐劑而應(yīng)用。

壓瘡模型中適應(yīng)性免疫細(xì)胞CD4+T細(xì)胞傾向向Th17細(xì)胞亞群分化，Th17/Treg細(xì)胞比例失衡，導(dǎo)致壓瘡創(chuàng)面的持續(xù)性炎癥反應(yīng)，而多酚類黃芩苷應(yīng)用后促進(jìn)機體Th17/Treg細(xì)胞恢復(fù)平衡，控制過度炎癥損傷，這為臨床壓瘡治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為新型生物制劑的研制提供新思路。