侯陽，劉學政

(1.錦州醫(yī)科大學生命科學研究院；2.錦州醫(yī)科大學人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121000)

視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種具有代表性的退行性視網膜變性疾病。即患者最終都會因視網膜感光細胞死亡而致視功能下降甚至完全喪失。RP已成為發(fā)達國家主要的致盲性眼病?；疾÷始s0.03%。目前主要治療方法為藥物治療、視網膜色素上皮移植以及新近展開研究的基因治療，但對RP的臨床治療效果仍不理想。N-甲基-N-亞硝基脲(MNU) 屬于亞硝基化合物中的亞硝酸胺類，是廣泛分布于環(huán)境中的強烷化劑。烷化劑對細胞DNA的損傷如果沒有被修復，則細胞將發(fā)生凋亡。由于MNU誘導的感光細胞損害具有高度的可重復性，這種動物模型成為研究人類視網膜變性治療措施的有用工具。前期很多實驗證實人參皂苷單體對神經細胞和視神經損傷有保護作用[1-4]。本課題探討人參莖葉總皂苷對大鼠MNU所致RP的作用及機制。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

MNU(Sigma公司)、生理鹽水(沈陽志鷹制藥廠)、Beclin-1和LC3抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、食用色素(上海獅頭牌)。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠30只，100～120 g，雌雄各半，由北京華阜康生物技術有限公司提供，合格證號SCXK(京)。

1.3 儀器

Morris水迷宮由上海欣軟信息科技有限公司生產，光學顯微鏡(OLYMPUS，BX60，Japan)，視覺電生理檢測儀(重慶康華公司，YT 2B)，流式細胞儀。

2 方 法

2.1 動物分組及給藥

SD大鼠分3組，即空白對照組、模型組及治療組。模型制備參考文獻[5]，空白對照組腹腔注射生理鹽水后作為對照。模型組腹腔注射MNU 60 mg/kg；治療組在MNU 60 mg/kg腹腔注射1次，治療組連續(xù)7 d灌胃人參莖葉總皂苷50 mg/kg。

2.2 視覺電生理檢測

閃光視網膜電圖檢測(flashelectroretinogram，ERG) 具體步驟，參照文獻[5]2689-2702。動物檢查前暗適應過夜，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，0.5%托吡卡胺滴眼液點眼散瞳，ERG接地電極為針型電極，埋植于大鼠耳垂；參考電極也為針型電極，埋植于大鼠下唇；所有操作均在微弱的紅燈下暗室進行。記錄a和b波振幅及峰值期，a波振幅是從基線到a波波谷的電位值，a波峰值期為從光刺激開始至a波的波峰時間；b波為a波波谷到b波波峰的電位值，b波峰值期為從光刺激開始至b波的波峰時間，振幅的單位為微伏(μV)，峰值期的單位為毫秒(ms)。

2.3 光鏡形態(tài)學觀察

實驗結束，處死大鼠，取眼球，固定，石蠟包埋前，剪開角膜，取視網膜。常規(guī)脫水、浸蠟、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，拍照。

2.4 行為學實驗Morris水迷宮測試

參照文獻[6]，Morris水迷宮由圓形水池和自動錄像儀及分析系統(tǒng)兩部分組成。圓形水池直徑160 cm、高55 cm，內壁及底為黑色，站臺直徑9 cm，高度在20～35 cm之間調節(jié)。圖像采集卡：可存儲為AVI，圖象分辨率可達640 pix×480 pix，采集頻率1～25幀/秒可調。水溫(22±1)℃，水中加入黑色無毒食用色素，首先進行訓練，水中不放站臺。訓練后再進行2次水池中放有站臺的訓練，站臺高出水面2 cm。站臺所在象限有一圓形標志物，該標志物高出水面1.5 cm。訓練中如果在規(guī)定的最長時間120 s內未到達站臺，則由實驗者將其引至站臺，使大鼠在站臺停留15 s。檢測實驗由4次試驗組成，大鼠在站臺停留15 s后進行下一輪測試。120 s內未找到站臺逃避潛伏期則記為120 s，觀察并記錄動物找到并爬上站臺的潛伏期、總時間、路程、速度。

2.5 檢測Beclin-1和LC3蛋白的表達

參考文獻[7]，取視網膜，常規(guī)組織處理方法，剪碎、勻漿、吹散，過濾后，離心。按照說明書，加入一抗、洗滌、二抗，PBS洗滌。流式細胞儀檢測Beclin-1和LC3蛋白的表達。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結 果

3.1 人參莖葉總皂苷對MNU所誘導大鼠RP的視覺電生理(FERG)和光鏡下形態(tài)學的影響

各組大鼠視網膜電圖見圖1?？瞻讓φ战M均可記錄到典型的ERG波形，a、b波振幅明顯；MNU組大鼠a、b波振幅基本消失，與NC組比較差異顯著；治療組大鼠a、b波振幅出現(xiàn)，與MNU組比較明顯改善，有顯著性差異。結果提示尼莫地平可拮抗MNU所誘導大鼠RP視功能的下降。

光鏡下形態(tài)學比較：結果顯示NC組大鼠視網膜外核層細胞排列密集整齊；MNU組大鼠外核層細胞明顯減少，治療組較模型組比較，外核層細胞數(shù)目明顯增加，排列緊密。

空白對照組ERG 模型組ERG 治療組ERG

空白對照組視網膜HE 模型組視網膜HE 治療組視網膜HE

3.2 治療組對MNU誘導視網膜變性大鼠Morris水迷宮試驗

模型組潛伏期、總時間、路程、速度明顯低于空白對照組，行為學的變化表明給予MNU后視功能改變；治療組與模型組比較總時間、潛伏期、路程、速度低于模型組。表明參莖葉總皂苷對MNU誘導視網膜變性大鼠視功能顯著改善作用，見圖2、表1。

空白對照組大鼠運動軌跡 模型組大鼠運動軌跡 治療組大鼠運動軌跡

表2 人參莖葉總皂苷對MNU誘導視網膜變性大鼠Morris水迷宮試驗

3.3 人參莖葉總皂苷對MNU所誘導大鼠RP的Beclin-1和LC3蛋白的影響

模型組與對照組比較，細胞Beclin-1和LC3陽性表達率增高；治療組與模型組比較Beclin-1 和LC3陽性表達率降低，見圖3。

Beclin-1

空白對照組 模型組 治療組

LC3

陽性表達率為29.0% 陽性表達率為67.3% 陽性表達率為40.0%

4 討 論

ERG被認為是檢測由神經退行性疾病引起的視覺通路異常的最有用的神經生理學技術[8]。雖然ERG的確切起源還不清楚，但它似乎是由內層產生的中央視網膜(神經節(jié)細胞及其軸突)[9]，因此，它反映了視網膜神經纖維層異常。本研究顯示，模型組大鼠ERG信號明顯減弱，表明視錐細胞感光功能逐漸喪失，與文獻一致[10]。

單次全身給藥MNU可減少外核層厚度，降低ERG反應，誘導光受體細胞死亡，所有這些都是視網膜變性的標志，類似于RP的特征癥狀[11]。在此，我們利用MNU誘導的RP大鼠模型與文獻相同，模型組視網膜外核層明顯受損傷。本研究表明人參莖葉總皂苷對MNU誘導視網膜變性大鼠視功能和形態(tài)學顯著改善作用。

Morris水迷宮實驗中定點航行實驗能夠反映動物空間記憶學習形成和再獲得的能力。空間探索實驗則能夠評價動物空間定位能力，證明了視力是影響水迷宮實驗結果的非認知能力之一。水迷宮成績好壞與色素變性嚴重程度即視網膜光感受器的存活數(shù)量存在相關性，且室內非對稱環(huán)境對其也有重要影響。采用Morris水迷宮實驗，對受視覺功能進行評估[6]50-63。本試驗結果顯示空白對照組潛伏期、總時間、路程明顯高于模型組，速度沒有明顯變化，行為學的變化表明給予MNU后視功能改變但不改變其運動。治療組與模型組比較潛伏期、總時間、路程低于模型組，速度沒有明顯變化，表明人參莖葉總皂苷對MNU誘導視網膜變性大鼠視功能顯著改善作用。綜合視功能和形態(tài)學結果，本研究提示人參莖葉總皂苷對MNU誘導RP大鼠有改善作用。

自噬在神經元存活、清除神經系統(tǒng)中的衰老細胞器和錯誤折疊蛋白以及保護神經元方面起著關鍵作用，Beclin-1作為一個鍵自噬調節(jié)因子，調節(jié)自噬小體的形成[12]。LC3也是自噬的一個標志。自噬主要發(fā)生在視網膜神經節(jié)細胞和Muller細胞，神經損傷后視網膜神經節(jié)細胞凋亡可能與自噬激活有關[13]。

在MNU誘導的光感受器細胞死亡過程中，通過抑制PI3K/mTOR通路激活自噬[14]。本研究中我們觀察人參莖葉總皂苷對AD所致家兔肺Beclin-1和LC3的影響，結果提示人參莖葉總皂苷對MNU誘導RP大鼠有保護作用，其機制可能與抑制Beclin-1和LC3蛋白表達有關。

綜上所述，本研究通過動物模型實驗探討人參莖葉總皂苷對MNU誘導RP大鼠的作用及可能Beclin-1和LC3的影響。結果顯示，人參莖葉總皂苷對MNU誘導RP大鼠具有改善作用，并且可能與抑制Beclin-1和LC3有關。