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凍融即冷凍-融解，是一種比較常用的提取方法。是在-20℃以下冷凍，室溫或恒定溫度下緩慢融化的一種方法，是一種比較溫和的破壁方式，可以避免高溫對(duì)原料所造成的營(yíng)養(yǎng)損失等不良影響，也是使細(xì)胞破裂較為徹底的方法。目前凍融法多應(yīng)用于天然藥物的提取，如李敏康[1]采用凍融法提取豬血纖維蛋白原，確定了提取工藝條件；崔素萍等[2]為了提高大米蛋白質(zhì)的提取率，研究采用凍融及低頻超聲波處理大米漿體后，再用堿液法提取大米中的蛋白質(zhì)，大米蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)92.6%；郭衛(wèi)蕓等[3]通過(guò)反復(fù)凍融法破壁啤酒廢酵母的研究確定，當(dāng)反復(fù)凍融次數(shù)為3次時(shí)，破壁率高，可溶性蛋白溶出率較高。不同提取劑和提取方法獲得的柿多糖在抗氧化和抗菌方面表現(xiàn)出較大差異，說(shuō)明提取的過(guò)程與其生物學(xué)效能密切相關(guān)[4]；溫梓辰等[5]通過(guò)探究反復(fù)凍融法對(duì)枸杞多糖溶出率的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，驗(yàn)證反復(fù)凍融法對(duì)枸杞多糖的提取效果，反復(fù)凍融法提取枸杞多糖的最佳工藝組合為：解凍溫度45℃，凍融次數(shù)4次，凍結(jié)時(shí)間3 h，凍結(jié)溫度-28℃；魏文志等[6]研究發(fā)現(xiàn)可以凍融輔助超聲波法提取小球藻多糖物質(zhì)，回收率高。以上可以看到目前很多動(dòng)植物的提取涉及凍融環(huán)節(jié)，且大多數(shù)提取物質(zhì)為蛋白、多糖類，這類處理往往具有復(fù)雜的生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)，在整個(gè)工藝環(huán)節(jié)中大多使用1次或多次的凍融環(huán)節(jié)，以確保有效成分能夠有效地提取及雜質(zhì)能夠徹底地分離，凍融的方式有多種，也有不同的凍融周期，往往在凍融的過(guò)程中會(huì)因冷凍時(shí)間、溫度及解凍時(shí)間、溫度的不同的對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生巨大的影響，特別是解凍方式的選擇，由于提取液體積大，解凍時(shí)間長(zhǎng)，部分部位或物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生變質(zhì)，因此解凍方式也是凍融能否成功的關(guān)鍵步驟。本文通過(guò)實(shí)例對(duì)幾種解凍方式的對(duì)比分析，確定何種方式能夠效率最高，并且滿足生產(chǎn)需求。

應(yīng)用實(shí)例

兔肌肉富含多肽、嘌呤等物質(zhì)，通過(guò)反復(fù)凍融提取試驗(yàn)，可以將有效成分分離，其質(zhì)量直接影響制劑的質(zhì)量。多組分生化藥品是一類特殊時(shí)期產(chǎn)生的特殊藥品，目前雖然爭(zhēng)議較大但是仍有很多此類產(chǎn)品被證明擁有很好的療效，具有針對(duì)性強(qiáng)、毒性低、不良反應(yīng)小以及易被人體吸收等特點(diǎn)。生化藥品是從生物體分離、純化所得，來(lái)源于動(dòng)物體，包括氨基酸及衍生物、多糖、酶及輔酶、脂類、多肽于蛋白、核苷酸及衍生物、多組分提取物。為保證藥品的有效性和安全性，這類藥品更需要關(guān)注過(guò)程控制，保證過(guò)程中產(chǎn)品質(zhì)量得到最嚴(yán)格的控制。本文主要研究兔肌肉提取物多個(gè)凍融環(huán)節(jié)為研究對(duì)象，確定每個(gè)環(huán)節(jié)的最佳凍融方式。

表1 凍融①不同緩化方式情況對(duì)比分析

表2 凍融②不同緩化方式情況對(duì)比分析

表3 凍融③④不同緩化方式情況對(duì)比分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)：⑴兔肌肉提取工藝簡(jiǎn)述：白條兔→凍融①→剔出有效成分→冷凍→凍融②→一次勻漿→冷凍→凍融③→二次勻漿→冷凍→凍融④→提取→冷凍→凍融⑤→一次超濾→冷凍→凍融⑥→二次超濾。以上可以看到兔肌肉的提取過(guò)程中需要6次的凍融環(huán)節(jié)。這些環(huán)節(jié)的控制會(huì)影響到藥品質(zhì)量的好壞。⑵批量：取白條兔300 kg，剔出有效部位后開始進(jìn)行后續(xù)凍融研究工作。以上可以看到每批產(chǎn)品使用到原材料用量較大，凍融工作量復(fù)雜。⑶凍融標(biāo)準(zhǔn)：確保凍融徹底且無(wú)肌肉組織腐敗氣味產(chǎn)生。兔肌肉含有很多蛋白，多肽，氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，容易腐敗，提取工藝需要保證產(chǎn)品質(zhì)量。⑷“凍融①”方法的選擇：此步驟需要將冷凍的白條兔緩化后將有效部分剔出轉(zhuǎn)入下道工序。目前我們有3種緩化方式：①自然緩化方式：常溫放于緩化盤內(nèi)，隔夜緩化。②水浴緩化方式(浸泡緩化)：白條兔放于純化水中，隔夜緩化。③常溫循環(huán)泵緩化方式(流動(dòng)水緩化)：生產(chǎn)當(dāng)日放入循環(huán)緩化槽內(nèi)緩化。⑸“凍融②”方法的選擇：此步驟需要將冷凍的兔肉緩化后進(jìn)行勻漿操作。①自然緩化方式：常溫放于緩化盤內(nèi)，隔夜緩化后開始勻漿。②常溫水浴緩化方式：白條兔放于純化水中，隔夜緩化后開始勻漿。③常溫循環(huán)泵緩化方式：生產(chǎn)當(dāng)日放入循環(huán)緩化槽內(nèi)，緩化后開始勻漿。⑹凍融③④方法的選擇：此兩步驟的緩化均屬于勻漿液緩化，內(nèi)部物質(zhì)相同，因此可選擇一種緩化方式。①自然緩化方式：隔夜取出后進(jìn)行二次勻漿或提取。②常溫水浴緩化方式：隔夜取出后進(jìn)行二次勻漿或提取。③恒溫循環(huán)泵水浴緩化方式：隔夜取出后進(jìn)行二次勻漿或提取。⑺凍融⑤⑥：此兩個(gè)步驟的緩化均屬于超濾前藥液的緩化，緩化方式相同。①自然緩化方式：隔夜取出后進(jìn)行超濾。②常溫水浴緩化方式：隔夜取出后進(jìn)行超濾。③恒溫循環(huán)泵水浴緩化方式：隔夜取出后進(jìn)行超濾。

結(jié)果與分析：凍融①方式的不同對(duì)質(zhì)量的影響：凍融①解凍的是整只白條兔，由于緩化方式不同導(dǎo)致工藝用時(shí)，緩化結(jié)果也不同，雖然兔肌肉僅從外觀性狀上觀察，但是緩化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致白條兔表面發(fā)生變化，容易導(dǎo)致在緩化過(guò)程中表面的微生物繁殖，產(chǎn)生不良影響，因此本步驟采用循環(huán)緩化槽緩化較理想。見表1。

凍融②方式的不同對(duì)質(zhì)量的影響：此步驟中凍融的是從有效部位剔除的兔肌肉，由于兔肌肉長(zhǎng)時(shí)間和空氣或純化水接觸，容易滋生微生物，因此關(guān)鍵在于降低接觸時(shí)間，快速達(dá)到緩化的目的。常溫循環(huán)泵緩化既能夠保證低溫又能夠保證快速緩化，是最為有效的一種緩化方式。見表2。

凍融③④方式的不同對(duì)質(zhì)量的影響：兔肌肉提取物屬于肌肉組織，是勻漿液，里面富含多肽、氨基酸等有機(jī)物質(zhì)，極易在長(zhǎng)時(shí)間常溫的過(guò)程中造成微生物繁殖，而在提取物過(guò)程中，凍融徹底與否直接影響著本批次的含量情況。所以選擇一種合適的緩化方式既能夠保證含量又能夠保證質(zhì)量，綜合恒溫循環(huán)泵水浴緩化(18℃)方式較為合理。見表3。

凍融⑤⑥方式的不同對(duì)質(zhì)量的影響：此步驟由于提取后藥液密度較小，因此緩化速度較前幾步稍快，但緩化方式的選擇同樣影響著緩化的效果。最終選擇低溫的方式能夠?qū)⑺幰壕徎瘡氐?，進(jìn)一步保證了藥液的低溫狀態(tài)，能夠保證產(chǎn)品質(zhì)量。見表4。

結(jié)果與討論

本文以兔肌肉提取物生產(chǎn)過(guò)程中的各個(gè)緩化環(huán)節(jié)為例，經(jīng)過(guò)對(duì)比的方式進(jìn)行各種緩化方式的選擇，其目的就是為了最大限度的降低在緩化過(guò)程中所產(chǎn)生的微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步保證產(chǎn)品的質(zhì)量?？梢钥吹皆谌诨^(guò)程中我們使用了緩化槽，緩化槽是這樣的一種裝置它可以自動(dòng)控溫，通過(guò)采用夾層保溫及頂蓋保溫的方式有效減少了環(huán)境溫度導(dǎo)致的槽內(nèi)溫度升高。緩化過(guò)程中，緩化槽內(nèi)加入潛水泵，這種潛水泵可以加快槽內(nèi)水的流動(dòng)，使整個(gè)緩化槽保持溫度均勻一致。同時(shí)在控制的時(shí)候，我們采用水位固定、裝載方式固定、加熱方式固定、時(shí)間固定的方式有效保證了產(chǎn)品的批次間的一致性。同時(shí)我們?cè)O(shè)計(jì)了合適的裝載容器，增大了緩化面積，縮短了緩化時(shí)長(zhǎng)，更有利于緩化的均勻性。合適的容器，合適的溫度時(shí)長(zhǎng)，既讓有效成分充分提取分離又控制了微生物的滋生，和降壓物質(zhì)的產(chǎn)生，使產(chǎn)品符合質(zhì)量控制的要求。

表4 凍融⑤⑥不同緩化方式情況對(duì)比分析

本文以兔肌肉提取為例，找出天然藥物提取分離過(guò)程中凍融環(huán)節(jié)最佳控制方式。本文所使用的恒溫循環(huán)泵水浴法大大降低了緩化過(guò)程中的時(shí)間并增強(qiáng)了緩化的效果，可以有效防止由于局部溫度升高引起的質(zhì)量不合格問(wèn)題，為指導(dǎo)天然藥物提取分離過(guò)程中的凍融環(huán)節(jié)控制提供依據(jù)。