劉 娜， 管淑玉， 徐 鵬， 楊然存， 于阿娟

（1.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，鄭州 450001； 2.國家建筑裝修材料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州 450001；3.鄭州大學化學學院，鄭州 450002）

黃連（Rhizoma coptidis）是一種重要常用的中草藥. 傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為黃連具有清熱解毒，瀉火燥濕等功效［1］. 現(xiàn)代藥理學研究顯示，黃連中小檗堿、巴馬汀、藥根堿等原小檗堿型生物堿作為主要活性成分具有消炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、降血壓等作用［2］. 以黃連為原料的中成藥品中有黃連上清片、復方黃連素片、加味香連丸等上百種，在臨床上得到了廣泛的應用，并有新型復方制劑不斷研制出來.

中國藥典（2015版）一部中，黃連的含量測定采用液相色譜法對鹽酸小檗堿、巴馬汀等進行測定［3］. 眾所周知，中藥藥效是藥材中多種活性成分共同作用的結(jié)果，因此建立同時測定黃連藥材中多種活性成分的便捷、快速、準確的分析方法，對藥材及制劑的質(zhì)量控制有重要的意義.

近來文獻報道測定該類物質(zhì)的方法中［4-20］，高效液相色譜法（HPLC）以其方便、快速、高專屬性，相對于液質(zhì)等串聯(lián)技術成本低廉而被廣泛采用. 然而多數(shù)報道反映出各生物堿色譜峰拖尾嚴重，尤其是藥根堿等與相關物質(zhì)色譜峰嚴重重疊、不能有效同時分離多種生物堿等問題. 一些研究認為在流動相中添加離子對試劑可以減小色譜峰拖尾、增加各生物堿之間的分離度. 然而在實際應用中發(fā)現(xiàn)，伴隨著離子對試劑的使用，常常出現(xiàn)基線噪音大、平衡時間過長、色譜柱使用壽命變短等不利因素. 因此，本文擬建立一種非離子對環(huán)境下，快速、靈敏、高選擇性的反相高效液相色譜法同時測定黃連中的小檗堿、巴馬汀、藥根堿，為黃連及其制劑的質(zhì)量評價提供依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

Waters 2695 HPLC 系統(tǒng)，包括2996 DAD 檢測器、Empower 2 工作站（美國Waters 公司）；Agilent Zorbax C18（250 mm×4.6 mm；5 μm；Agilent）色譜柱.

甲醇、乙腈為色譜純（Merck，德國），其他試劑均為分析純，實驗用超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，美國）制備. 鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿標準品購自中國藥品生物制品檢定所. 黃連（味連）藥材購自鄭州藥材市場.

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent）色譜柱. 流動相A：乙腈；流動相B：0.02 mL/mol 磷酸二氫鉀溶液（含0.2%三乙胺，H3PO4調(diào)pH 值3.0）；梯度洗脫程序：0～40 min V（A）%：15%～38%，40～50 min V（A）∶V（B）=38∶62；流速1 mL/min. 檢測波長265 nm；柱溫：25 ℃；進樣量5 μL.

1.2.2 標準貯備液配制 準確稱取鹽酸小檗堿9.0 mg、鹽酸巴馬汀3.1 mg、鹽酸藥根堿1.0 mg于50 mL容量瓶中用甲醇溶解并定容. 即為鹽酸小檗堿濃度為180 μg/mL、鹽酸巴馬汀62 μg/mL、鹽酸藥根堿20 μg/mL的標準貯備液，放置于-4 ℃的冰箱中備用.

1.2.3 樣品制備 黃連藥材粉碎后過3號篩，準確稱取藥材粉末0.025 g用鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）溶液定容至25 mL，超聲30 min，冷卻后補足損失備用.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法

實驗中分別采用常溫水、熱水（50 ℃）、不同濃度的甲醇-水及鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）溶液對樣品進行超聲提取. 發(fā)現(xiàn)100%甲醇對3 種生物堿的提取效果最佳，與鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）溶液基本相同（圖1），但在后者色譜圖中出現(xiàn)較多的未知峰，經(jīng)與空白溶液圖譜對比這些峰主要來自樣品本身. 為了更好地反應樣品本身的化學信息，實驗選擇后者為提取溶劑. 萃取溶液中添加適量的鹽酸有助于使原小檗堿型生物堿以鹽酸鹽形式存在，從而更容易溶于提取溶劑. 經(jīng)實驗考察1%的鹽酸足夠鹽酸鹽的形成，過高的鹽酸含量會腐蝕儀器管路. 在提取時間選擇上，發(fā)現(xiàn)30 min 已將目標物提取充分，故提取時間選擇30 min（圖2）.

圖1 不同溶劑對提取效果的影響Fig.1 Extraction efficiency of different extraction solvents

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 檢測波長的選擇 將3 種生物堿標準溶液分別在190～400 nm紫外波長下掃描，結(jié)果均在265、345 nm處有最大吸收，但345 nm波長下的色譜圖基線較265 nm下平穩(wěn). 可能是由于一些含有機氮原子但分子結(jié)構較小或共軛鏈較短的化合物在265 nm附近有吸收，而在345 nm附近無吸收. 故將波長設在265 nm處，既可對目標物進行準確定量又可兼顧相關物質(zhì)的有效檢出，能更好地反映出樣品中的化學信息，故選擇265 nm作為檢測波長（圖3）.

圖2 不同提取時間的提取效果Fig.2 Extraction efficiencies of different extraction times

圖3 黃連的樣品色譜圖Fig.3 Typical chromatograms of Rhizoma coptidis

2.2.2 流動相的選擇 曾先后探索了等度系統(tǒng)：甲醇-水、乙腈-水、乙腈-三乙胺-磷酸-水溶液、甲醇-三乙胺-醋酸-水溶液、甲醇-磷酸二氫鉀-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-磷酸二氫鉀-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀-十二烷基磺酸鈉-三乙胺-磷酸-水等流動相體系；梯度系統(tǒng)：乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-磷酸二氫鉀-三乙胺-磷酸-水溶液、乙腈-磷酸二氫鉀-十二烷基磺酸鈉-三乙胺-磷酸-水等流動相體系. 實驗發(fā)現(xiàn)在上述流動相條件下巴馬汀與小檗堿在多數(shù)情況下分離情況比較滿意，然而藥根堿與相鄰峰的重疊比較嚴重甚至完全重疊. 只有乙腈-磷酸二氫鉀-三乙胺-磷酸-水溶液梯度系統(tǒng)獲得最佳分離效果. 另外，三乙胺作為改性劑可以抑制不良硅羥基效應改善峰形. 經(jīng)考察流動相中含0.2%的三乙胺已經(jīng)足夠掩蔽解離的硅羥基，繼續(xù)增大其濃度除化合物保留值減小外，對分離無顯著改善.

2.2.3 色譜柱的選擇 分別考察了Elite Hypersil BDS C18 column（5 μm，200 mm×4.6 mm），Dikma Diamonsil ODS C18 column（5 μm，150 mm×4.6 mm），Dikma Diamonsil ODS C18 column（5 μm，200 mm×4.6 mm），Water Symmetry C18 column（5 μm，150 mm×4.6 mm），Agilent Zorbax SB C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）等色譜柱. 在選擇的流動相條件下3種生物堿在Zorbax SB C18上獲得了最佳的分離. Zorbax SB C18采用的是弱酸性的硅膠（B型硅膠），一般對離子或可電離化合物，尤其是堿性化合物分離較好. 故采用Zorbax SB C18色譜柱進行色譜分析.

2.2.4 pH值的選擇 較低的pH值可以抑制固定相上硅羥基的解離，但過高或過低的pH值都均對固定相不利，尤其是在較高溫度下會造成固定相的流失. 實驗分別考察了pH 2.5、2.8、2.9、3.0條件下的分離狀況. 在pH值2.5～3.0范圍內(nèi)，分離狀況無較大差異. 故選擇pH 3.0.

2.2.5 柱溫的選擇 由于離子型樣品對溫度變化很敏感. 故實驗中應保持柱溫恒定. 實驗分別考察了20、25、30、35、40 ℃條件下各生物堿的分離情況. 發(fā)現(xiàn)溫度對藥根堿與相鄰物質(zhì)色譜峰的分離很關鍵，高于或低于25 ℃時均會增加其與相鄰峰的重疊. 故選擇實驗應恒溫在25 ℃.

2.3 標準曲線線性范圍和檢出限

將1.2.2節(jié)的標準貯備液適當稀釋成不同濃度的標準溶液，按標準曲線步驟進行實驗. 結(jié)果見表1.

表1 標準曲線線性范圍和檢出限Tab.1 Linearity of standard curve and limit of detection

2.4 方法精密度

同一天內(nèi)對同一標準溶液連續(xù)進樣六次，以峰面積的相對標準偏差考察精密度，相對標準偏差分別為藥根堿0.73%、巴馬汀0.57%、小檗堿0.53%.

2.5 加標回收實驗

分別稱取9 份平行樣品，加入3 種不同濃度水平的標準溶液，進行加標回收實驗（n=3），平均回收率在92.9%～105.9%之間，結(jié)果見表2.

表2 樣品加標回收實驗Tab.2 Results of sample spiked recovery tests（n=3）

2.6 樣品測定

在選定的色譜條件下，取對照品溶液及樣品溶液5 μL 進樣，測定峰面積值，按外標法定量. 不同批次黃連藥材中生物堿的含量測定結(jié)果見表3.

表3 樣品測定結(jié)果Tab.3 Contents of alkaloids in samples（n=3） 單位：mg·g-1

3 結(jié)論

原小檗堿型生物堿是季銨堿，具有較強的堿性，在普通流動相中主要以陽離子形式存在，易與固定相上解離的硅羥基牢固結(jié)合造成色譜峰拖尾. 另外黃連中的非洲防己胺和藥根堿是位置異構體，表小檗堿和這對異構體分子量只相差2，更加造成了對該類生物堿進行分離分析的難度.

本實驗對色譜柱、流動相、pH、柱溫等色譜條件進行了考察優(yōu)化. 采用非離子對環(huán)境下的反相高效液相色譜法對9 個批次黃連樣品中的3 種生物堿進行測定，結(jié)果表明：①在流動相中不添加離子對試劑的情況下，黃連中的多種生物堿完全可以實現(xiàn)良好的分離. ②當前市售黃連藥材中各生物堿的含量變化范圍很大，因此市售黃連藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性需要加強控制.