劉藝平, 蘇少文, 張琳, 黃志遠(yuǎn), 劉瑩, 賀丹, 孔德政

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

鹽漬化是一個(gè)全球性的社會和經(jīng)濟(jì)問題[1]。中國現(xiàn)有不同程度的鹽堿地面積約占全球鹽堿地總面積的10%[2-3]，且鹽堿地面積仍呈逐年增加的趨勢[4]。因而，潛在的土地資源即鹽漬化土地受到重視。在鹽漬化土壤中種植具有一定耐鹽性、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的植物，不僅可有效地利用土地資源，而且可以改善其生態(tài)環(huán)境。因此，探討植物抗鹽的生理機(jī)制對擴(kuò)大鹽堿地植物種植面積和改善生態(tài)環(huán)境具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。研究表明，外源鈣添加能夠提高植物對干旱、鹽分和重金屬的多種抗性[5-8]，從而緩解逆境脅迫對抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的傷害和植株生長的抑制[6-7]。韓冰等[6]研究了鈣對鹽脅迫下黃瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)外源鈣離子可以有效提高黃瓜幼苗的可溶性蛋白含量和CAT、POD抗氧化酶活性，并使之維持在較高的水平。荷花(Nelumbonucifera)隸屬于睡蓮科蓮屬,是中國的傳統(tǒng)名花和重要的水生植物之一，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]。荷花因其花色艷麗、花型豐富、氣味芳香，而受到眾人喜愛，被廣泛應(yīng)用于園林造景之中[10]。隨著土壤鹽分濃度的增加，其栽培與生產(chǎn)已受到影響，普通的荷花品種對鹽脅迫更為敏感。目前關(guān)于荷花耐鹽性研究報(bào)道主要集中在鹽脅迫[11-12]、耐鹽相關(guān)基因[12-14]和外源鈣對荷花幼苗鹽脅迫緩解效應(yīng)[15-16]等方面，但研究中涉及的品種是以藕蓮為主[15-16]，關(guān)于觀賞蓮耐鹽性研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)通過添加外源CaCl2，初步探討外源CaCl2對鹽脅迫下荷花生長生理的影響，為利用添加外源物質(zhì)方法減輕鹽脅迫傷害提供科學(xué)依據(jù)及在生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料由河南駐馬店荷花培植研究會(鄭州基地)提供，品種為‘鳳舞’‘粉美人’‘紅樓’‘鮮嬌’‘春紅’和‘水晶粉七號’等生長健壯、形態(tài)基本一致 (高度約為53 cm) 的荷花，定植于直徑為50 cm，高40 cm的橡膠花盆中，單株定植。試驗(yàn)在河南省優(yōu)質(zhì)花卉蔬菜種菌工程研究中心露天苗圃地中進(jìn)行，平均溫度為32 ℃。試驗(yàn)期間不另施肥，雨天將荷花移到室內(nèi)，并觀測荷花葉片形態(tài)特征變化。

1.2 試驗(yàn)處理

選取生長健壯均勻的植株，待長出3～5片葉時(shí)，先進(jìn)行NaCl處理，設(shè)置5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，共75株，處理7 d后測量株高和鹽害指數(shù)。NaCl處理后篩選出鹽抗性品種與鹽敏感品種，再選取生長健壯均勻的植株，待長出3～5片葉時(shí)，進(jìn)行外源鈣處理(6個(gè)處理)，每個(gè)處理重復(fù)3次，共36株。處理7和14 d后采集荷花植株葉片，實(shí)驗(yàn)室剪樣，液氮冷凍，儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 鹽害指數(shù)的測定 采用鹽害級別判定標(biāo)準(zhǔn)[17-18]進(jìn)行耐鹽性評價(jià)。對全部植株進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì), 計(jì)算植株各處理的鹽害指數(shù)。鹽害分級標(biāo)準(zhǔn)為一級:生長正常，無明顯鹽害癥狀;二級:輕度鹽害，少數(shù)葉片尖緣枯焦或黃化；三級:中度鹽害，1/2葉片尖緣枯焦黃化或少量葉片脫落失水萎蔫;四級:重度鹽害，大部分葉片枯焦，1/2左右葉片脫落;五級:極重度鹽害，多數(shù)葉片脫落，枝條枯死，植株瀕臨死亡。鹽害指數(shù)計(jì)算公式如下:

鹽害指數(shù)/%=[∑(鹽害級值×相應(yīng)鹽害級值株數(shù))/(總株數(shù)×鹽害最高級值)]×100。

表1 不同濃度的NaCl處理Table 1 Different concentrations of NaCl treatment mmol·L-1

表2 鹽脅迫下不同濃度的CaCl2處理Table 2 Treatment of different concentrations of CaCl2 under salt stress mmol·L-1

1.3.2 生長生理指標(biāo)的測定 用尺子測量植株的株高，重復(fù)測量3次，取其平均值;凈高生長量計(jì)算公式如下：凈高生長量=NaCl處理7 d后平均株高-原始平均株高;POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[19]，CAT活性采用紫外吸收法測定[19]，SOD 活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定[19]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定[19]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行初步分析，并使用SPSS19.0進(jìn)行方差分析，分析其差異顯著性，使用Excel和OriginPro 8繪制各項(xiàng)指標(biāo)變化圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對荷花株高的影響

鹽脅迫對植物的傷害作用中最明顯的就是抑制植物的生長。由表3可看出，所有荷花品種在沒有NaCl處理下，7 d后凈高生長量的范圍為12.0～15.6 cm。其中‘水晶粉七號’的凈高生長量最大，達(dá)到15.6 cm；‘粉美人’的凈高生長量最小，達(dá)到12.0 cm。在NaCl濃度從0升高至100 mmol·L-1時(shí)，所有品種的凈高生長量平緩下降，在NaCl濃度為100 mmol·L-1時(shí)，凈高生長為5.7～10.9 cm。當(dāng)NaCl濃度為150 mmol·L-1時(shí)，所有品種凈高生長量均大幅下降，‘粉美人’的凈高生長量下降最為顯著，與對照組相比下降82.50 %。當(dāng)NaCl濃度為200 mmol·L-1時(shí)，所有品種的凈高生長量范圍僅為1.3～3.3 cm，此時(shí)‘粉美人’的凈高生長量最小，僅為1.3 cm，植株基本不生長。這些數(shù)據(jù)表明150和200 mmol·L-1NaCl處理對荷花的生長有明顯的抑制作用，荷花凈高生長量最小甚至停止生長，說明此濃度下對荷花的危害很大。

表3 NaCl脅迫對荷花凈高生長量的影響

采用鹽害級別判定標(biāo)準(zhǔn)[18-19]對荷花植株的耐鹽性進(jìn)行評價(jià)。在NaCl處理試驗(yàn)中，對全部植株外觀特征進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì), 并計(jì)算植株各處理的鹽害指數(shù)。由表4可看出，綜合鹽害指數(shù)平均值來看，各品種耐鹽能力排序?yàn)椤Х燮咛枴?‘鮮嬌’>‘春紅’>‘紅樓’>‘鳳舞’>‘粉美人’，‘水晶粉七號’抗性最強(qiáng)即為鹽抗性品種，‘粉美人’抗性最弱為鹽敏感品種。

表4 NaCl脅迫下荷花的鹽害指數(shù)Table 4 Salt damage index of lotus under NaCl stress %

2.2 外源鈣對NaCl脅迫下荷花POD活性的影響

如圖1所示，T1處理時(shí)，2種荷花葉片的POD活性均顯著高于對照組T0。與T0和T1相比，不同濃度的外源CaCl2處理均能提高鹽脅迫下荷花葉片的POD活性，其中以T3和T4處理下的POD活性最高。在T3處理下，7 d后敏感品種和抗性品種的POD活性與NaCl單獨(dú)處理相比，達(dá)到了57.95和71.86 U·g-1，分別增加了25.47%和21.12%；在T4處理下，14 d后敏感品種‘粉美人’和抗性品種‘水晶粉七號’的POD活性較T1處理分別增加了24.89%和4.15%，這表明在15 mmol·L-1CaCl2處理下敏感品種‘粉美人’的POD活性較抗性品種‘水晶粉七號’的增幅較大。而T4與T5處理差異不顯著，且均為T4處理優(yōu)于T5。這說明高濃度的CaCl2處理可能不存在顯著的抑制作用。

圖1 外源CaCl2對鹽脅迫下敏感品種和抗性品種7和14 d后POD的影響Fig.1 Effects of exogenous CaCl2 on POD in sensitive variety and tolerant variety under salt stress after 7 d and 14 d

2.3 外源鈣對NaCl脅迫下荷花CAT活性的影響

圖2為不同處理下荷花葉片CAT活性的變化趨勢，抗性品種‘水晶粉七號’和敏感品種‘粉美人’在T1處理下其CAT活性顯著增加，敏感品種的增幅較大。隨著CaCl2濃度的升高，2種荷花的CAT活性也呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，而當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到10～15 mmol·L-1時(shí)，其CAT活性開始下降。敏感品種在T4處理下7 d后CAT活性為最大值，達(dá)到了10.75 U·g-1，比對照組T0增加了57.37%；在T3處理下，14 d后CAT活性為最大值，達(dá)到了10.22 U·g-1，比對照組T0增加了41.72%。抗性品種在T3處理下，7 d后CAT活性為最大值，達(dá)到了10.57 U·g-1，比對照組T0增加了22.81%；14 d后CAT活性為最大值，達(dá)到了10.96 U·g-1，比對照組T0增加了33.40%。這說明,一定濃度范圍內(nèi)CaCl2處理確實(shí)能夠通過促進(jìn)抗氧化酶的活性來緩解鹽脅迫產(chǎn)生的危害。

圖2 外源CaCl2對鹽脅迫下敏感品種和抗性品種7和14 d后CAT的影響Fig.2 Effects of exogenous CaCl2 on CAT in sensitive variety and tolerant variety under salt stress after 7 d and 14 d

2.4 外源鈣對NaCl脅迫下荷花SOD活性的影響

由圖3可知，T1處理下7和14 d后，敏感品種荷花的SOD活性與對照組T0相比有顯著升高，敏感品種‘粉美人’的SOD活性比對照組T0分別增加了5.07%和13.68%，這表明敏感品種‘粉美人’的SOD活性隨著時(shí)間的延長其活性更大?？剐云贩N的SOD活性在T1處理下7和14 d后分別達(dá)到了278.37和294.35 U·g-1，比對照組T0分別增加了1.44%和2.79%，變化不大，但脅迫14 d后，敏感品種的SOD活性相較于對照組的增加量比抗性品種‘水晶粉七號’顯著提高。在添加CaCl2處理后，兩種荷花的SOD活性均有所升高，其中T3處理7和14 d后，敏感品種和抗性品種的SOD活性顯著升高，比對照分別高13.76%和8.4%，說明10 mmol·L-1CaCl2處理對鹽敏感品種‘粉美人’的效果更明顯。

圖3 外源CaCl2對鹽脅迫下敏感品種和抗性品種7和14 d后SOD的影響

2.5 外源鈣對NaCl脅迫下荷花可溶性糖含量的影響

由圖4可以看出，與對照相比，鹽脅迫7 d時(shí)敏感品種荷花葉片的可溶性糖含量顯著增加，抗性品種T3處理下增加顯著；14 d時(shí)敏感品種在T3處理后差異顯著，但抗性品種各處理濃度間差異不顯著。不同濃度的CaCl2處理后增加了鹽脅迫下荷花葉片的可溶性糖含量，與僅在鹽脅迫下有一定的差異，尤其以T3和T4處理較好，敏感品種‘粉美人’的可溶性糖含量T3處理7和14 d后分別比對照組增加11.20%和18.95%，抗性品種‘水晶粉七號’的可溶性糖含量T3處理7和14 d后分別比對照組增加29.78%和15.00%，這表明外源CaCl2可提高荷花葉片可溶性糖含量，有效地增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，對緩解鹽脅迫對葉片的損傷有一定作用。

圖4 外源CaCl2對鹽脅迫下敏感品種和抗性品種7和14 d后可溶性糖含量的影響

2.6 外源鈣對NaCl脅迫下荷花可溶性蛋白含量的影響

由圖5可以看出，2個(gè)荷花品種的可溶性蛋白含量在鹽脅迫下增加，并且通過CaCl2處理進(jìn)一步提高，主要呈現(xiàn)先上升再緩慢下降的趨勢?？剐云贩N‘水晶粉七號’葉片中的可溶性蛋白含量高于敏感品種‘粉美人’。不同濃度的CaCl2對可溶性蛋白含量的增加效果不同，T3處理下可溶性蛋白含量顯著增加。7 d后，敏感品種‘粉美人’在T3處理下的可溶性蛋白含量達(dá)到了7.49 mg·g-1，比對照組T0增加了58.36%；抗性品種‘水晶粉七號’的可溶性蛋白含量達(dá)到了6.83 mg·g-1，比對照組T0增加了44.09%。14 d后，敏感品種‘粉美人’和抗性品種‘水晶粉七號’的可溶性蛋白含量分別比對照組增加了25.87%和21.35%，這表明外源CaCl2對鹽脅迫下敏感品種‘粉美人’可溶性蛋白含量的增加起到一定的作用。

圖5 外源CaCl2對鹽脅迫下敏感品種和抗性品種7和14 d后可溶性蛋白含量的影響

2.7 外源鈣緩解鹽脅迫下荷花生長指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表5可知，對于鹽敏感荷花品種‘粉美人’，不同水體CaCl2的濃度與POD活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與CAT活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與抗氧化酶SOD、可溶性糖、可溶性蛋白的相關(guān)性不顯著。在控制CaCl2濃度變量的偏相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn)，POD活性與CAT活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，可溶性蛋白含量與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，SOD活性與可溶性蛋白含量、可溶性糖含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著外源鈣濃度的增加，細(xì)胞中的POD活性、CAT活性均呈上升趨勢，兩者相輔相成，共同抵御植物在鹽脅迫下受到的損傷。同時(shí)，可溶性糖與可溶性蛋白含量也在不斷的增加，共同維持細(xì)胞正常滲透壓。這也印證了添加外源鈣確實(shí)對鹽脅迫下的植物有一定的緩解作用。

表5 鹽敏感荷花品種‘粉美人’生理指標(biāo)的相關(guān)性

由表6可知，對于鹽抗性荷花品種‘水晶粉七號’，不同水體CaCl2的濃度與POD活性、CAT活性均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與其他生理指標(biāo)相關(guān)性不顯著。另外，在控制鈣濃度變量的偏相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn)，POD活性與CAT活性、SOD 活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，其他生理指標(biāo)之間相關(guān)性不顯著；SOD 活性與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著外源鈣濃度的增加，細(xì)胞中的CAT活性、POD活性也均呈上升趨勢，清除活性氧等有害物質(zhì)，共同抵御植物在鹽脅迫下受到的損傷。可見CAT、POD是外源鈣對鹽抗性荷花品種抵抗鹽脅迫逆境的重要響應(yīng)指標(biāo)。

表6 鹽抗性荷花品種‘水晶粉七號’生理指標(biāo)的相關(guān)性Table 6 Correlation of physiological indexes of salt-resistant lotus variety ‘Shuijingfen 7’

3 討論與結(jié)論

鹽分對非鹽生植物最重要的表現(xiàn)就是植物的生長受到抑制[20]。細(xì)胞內(nèi)鈣的平衡失調(diào)是植物鹽脅迫的原始反應(yīng)[21]，外源Ca2+能夠重建植株體內(nèi)離子平衡, 因而施加外源鈣是緩解鹽脅迫對植物造成傷害的重要途徑[22]。本試驗(yàn)表明，NaCl濃度從0升高至100 mmol·L-1時(shí)，所有荷花品種的凈高生長量均呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢；其中150和200 mmol·L-1NaCl處理對荷花的危害較大，荷花凈高生長量最小(1.3～6.9 cm)。添加濃度為10 mmol·L-1的CaCl2時(shí)，荷花抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均顯著提高，增強(qiáng)了植株對逆境的適應(yīng)能力。

植物細(xì)胞中存在著自由基的產(chǎn)生和消除過程，當(dāng)其受到鹽脅迫時(shí)，會造成植株體內(nèi)活性氧(ROS)大量積累[23]。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(-OH)等含氧自由基，也包括過氧化氫(H2O2))、單線態(tài)氧(1O2)等非自由基形式的含氧分子。當(dāng)生物自由基處于一個(gè)較低的水平，才能消除自由基的毒害。過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶協(xié)同作用影響著植物體內(nèi)自由基的含量，有效減少其對植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害[24-25]。以往的研究結(jié)果表明，外源Ca2+處理可以在一定時(shí)間保持植物根系抗氧化酶的活性，及時(shí)清除產(chǎn)生的活性氧[26]?；蛱砑舆m量的外源Ca2+能在一定程度上減輕鹽脅迫對植物生長的抑制作用，增加抗氧化酶活性，并使其保持在較高的水平，緩解鹽脅迫對植物生長造成的傷害[27]?？寡趸富钚詼y定表明，抗性品種‘水晶粉七號’的SOD和CAT活性較敏感品種‘粉美人’相對較高，導(dǎo)致O2-積累較少。李淑艷等[15]研究添加外源鈣對鹽脅迫下鹽敏感荷花品種影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的Ca2+可以顯著提高SOD活性，本研究與此結(jié)論相一致。SOD是最有效的細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，它能夠?qū)2-轉(zhuǎn)化為H2O2，而CAT是含有四聚體血紅素的酶，具有直接將H2O2分解成H2O和O2的潛力。這一結(jié)果符合在其他植物物種中獲得的結(jié)果，即鹽脅迫提高抗氧化酶活性和促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生[28-29]。

植物提高其耐鹽性的重要途徑之一是滲透調(diào)節(jié)，可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[30]。可溶性糖可提供碳骨架和能量，參與有機(jī)物的合成，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定[31]。本試驗(yàn)中，鹽抗性品種‘水晶粉七號’的可溶性糖含量明顯升高，同豌豆[32]和油菜[33]的研究結(jié)論相一致。印荔[16]研究藕蓮對鹽脅迫響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)添加外源鈣后可溶性蛋白含量顯著提高，與本研究結(jié)論不同。本試驗(yàn)中脅迫7 d后，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，脅迫14 d后的可溶性蛋白含量均低于脅迫7 d時(shí)，這可能是因?yàn)辂}脅迫使植株體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，且蛋白酶活性增強(qiáng)，從而加快其水解速度造成的[34]。

通過相關(guān)性分析，2種荷花不同Ca2+濃度與POD、CAT酶活性均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明隨著Ca2+濃度的不斷增大，荷花植株葉中的POD和CAT酶活性也不斷增加，以抵抗鹽脅迫傷害。表明添加外源Ca2+對鹽脅迫下的荷花具有明顯的緩解效應(yīng)。這與黃瓜幼苗[6]和水稻幼苗[7]在添加外源Ca2+緩解鹽脅迫的響應(yīng)相一致。

綜上所述，100 mmol·L-1的NaCl脅迫阻礙了荷花植株的正常生理和生化活動(dòng)。添加適宜濃度的外源Ca2+有效地緩解了鹽脅迫對植株的傷害，維持植株生理和生化代謝穩(wěn)定，增強(qiáng)荷花植株的耐鹽能力。