羅文學(xué)，王貴江，3，張軍輝，2，段曉紅，倪慧勇，王拴柱，郭彥軍，韓 杰

（1.河北省畜牧良種工作總站 050061；2.河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬遺傳資源開發(fā)利用與繁育崗位050061；3.河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系石家莊綜合試驗(yàn)推廣站 050061）

豬冷凍精液的研究是從1957 年由Hess 等人開始研究的，國(guó)內(nèi)豬冷凍精液技術(shù)始于20 世紀(jì)50 年代初期開始[1]，近年來(lái)，在百均達(dá)、北京田園奧瑞生物科技科技有限公司、北京農(nóng)學(xué)院等科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)的研究與應(yīng)用，現(xiàn)凍精生產(chǎn)設(shè)備、凍精試劑零突破，豬冷凍精液商品化高效生產(chǎn)應(yīng)用集成技術(shù)達(dá)到世界領(lǐng)先水平[2]，國(guó)內(nèi)豬冷凍精液技術(shù)有了質(zhì)的飛躍。 隨著豬冷凍精液技術(shù)的成熟， 豬冷凍精液技術(shù)被廣泛推廣和應(yīng)用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中[3]，豬的冷凍精液不但解決了豬精液長(zhǎng)期保存的問(wèn)題， 還利于高性能優(yōu)秀種公豬優(yōu)良基因得到無(wú)限期保存， 提高了優(yōu)秀種公豬利用率[4]；還使得種公豬精液資源引進(jìn)不受時(shí)間及地域限制，利于跨地域引進(jìn)協(xié)作，有利于聯(lián)合育種和品種改良，獲得較大的遺傳進(jìn)展；同時(shí)也降低規(guī)模化豬場(chǎng)引種公豬及其飼養(yǎng)種公豬的成本；從生物安全方面考慮，為疾病監(jiān)測(cè)提供了足夠的時(shí)間，為防治疾病傳播提供保障，降低由引種帶來(lái)的疫病風(fēng)險(xiǎn)。 由于豬精子在冷凍、解凍過(guò)程中容易受到損傷[5]，為探討影響豬冷凍精液精子活力因素，進(jìn)一步改進(jìn)豬精液冷凍技術(shù)及操作方法，因此，在相同環(huán)境下，采用統(tǒng)一凍精技術(shù)方法，實(shí)用統(tǒng)一設(shè)備對(duì)豬精液進(jìn)行凍精制作，對(duì)原精活力、采精量、精子重、密度與凍精精子活力進(jìn)行了相關(guān)分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和動(dòng)物

于2020 年1 月8 日-25 日，在河北省某豬場(chǎng)，按照豬精液冷凍工藝要求，選擇原精質(zhì)量達(dá)到密度≥2 億/mL、活率≥90%、畸形率≤10%的優(yōu)秀種公豬14 頭，開展了30 批次豬冷凍精液生產(chǎn)。

1.2 主要儀器和試劑

恒溫一體數(shù)碼顯微鏡、精液質(zhì)量分析系統(tǒng)、密度儀、精子分析儀、大容量離心機(jī)、程序控溫平衡儀、凍精細(xì)管噴碼機(jī)、全自動(dòng)細(xì)管灌裝機(jī)、程序冷凍儀、液氮低溫溫度計(jì)、恒溫水浴鍋、17℃恒溫冷藏箱、4℃冰箱、計(jì)時(shí)器、長(zhǎng)鑷子、剪刀、溫度計(jì)、燒杯或塑料杯若干個(gè)、豬冷凍試劑套裝、豬凍精解凍稀釋份、液氮、雙蒸餾水、新鮮雞蛋、紙巾等。

1.3 方法

1.3.1 稀釋液配置：根據(jù)采精計(jì)劃和采精種公豬數(shù)，估算出當(dāng)天的總采精量， 根據(jù)估算出的總采精量計(jì)算當(dāng)天應(yīng)配制稀釋液的總量，按稀釋粉使用規(guī)定配置稀釋液，配制2h 后方可使用，原因是稀釋液中某些成分需要時(shí)間來(lái)平衡；如當(dāng)天使用不完，應(yīng)在4℃保存，但保存時(shí)間不超過(guò)24h。

1.3.2 采精與檢測(cè)：當(dāng)公豬爬跨、挺出陰莖后，一手抓住陰莖并鎖定龜頭，一手持集精杯接取精液，主要采集富含精子射精中段部分，原精液大約為100～300mL，其前后射精部分應(yīng)棄掉，然后利用精子分析系統(tǒng)分析精子密度、活力等各項(xiàng)指標(biāo)，并計(jì)算總精子數(shù)。

1.3.3 精子稀釋：對(duì)于經(jīng)檢驗(yàn)合格的豬原精液，在精液采集完成后20min 內(nèi)，用冷凍精液專用稀釋液對(duì)原精液進(jìn)行1：1 等溫稀釋，稀釋液與原精液溫度相差不超過(guò)1℃。 稀釋后放入25℃室溫環(huán)境中平衡，使稀釋后精液溫度達(dá)到25℃，然后將稀釋后精液放入17℃恒溫箱，繼續(xù)平衡2～4h，使精液溫度達(dá)到17℃。

1.3.4 精子離心：離心前，對(duì)離心瓶稱重(g)，并將離心瓶置17℃預(yù)冷。 將17℃平衡好的精液裝入離心瓶，在17℃條件下，800轉(zhuǎn)/min 離心10min，用移液管或者注射器去掉上清液，對(duì)精子進(jìn)行稱重(g)。

1.3.5 平衡：將17℃預(yù)冷的冷凍稀釋液A 液緩慢加入裝有精子的離心瓶中，慢慢混勻，放入等溫水杯中置4℃平衡，降溫平衡3～4h，使其溫度達(dá)到4℃。然后往平衡好的精液中緩慢加入4℃預(yù)冷的冷凍稀釋液B 液并混勻。

1.3.6 精液灌裝：4℃低溫操作柜中使用灌裝封口一體機(jī)將精液分裝至0.5mL 細(xì)管中。

1.3.7 精液冷凍：開啟程序冷凍儀，選好冷凍曲線，將冷凍室溫度降到初始溫度4℃～5℃。 同時(shí)在低溫操作柜中將裝好精液的細(xì)管碼放至細(xì)管托架上， 在最上層額外摞一個(gè)空托架， 壓住細(xì)管。 待冷凍儀溫度穩(wěn)定在初始溫度后，打開冷凍室蓋子，迅速將碼好細(xì)管的托架放入冷凍室中，開始冷凍程序。 待冷凍曲線走完后，將托架迅速取出放入裝有液氮的泡沫箱中，液氮深度至少浸沒所有細(xì)管。

1.3.8 精液解凍：解凍液預(yù)熱至26℃～32℃。 0.5mL 細(xì)管按解凍程序37℃1min，50℃16s 或者70℃6s 解凍， 解凍后用解凍液稀釋10～15 倍，室溫孵育30min 后鏡檢。

1.3.9 精液保存： 檢測(cè)后將所有合格精液打包裝入紗布袋，做好標(biāo)記，存入液氮罐長(zhǎng)期保存。 定期檢測(cè)液氮量，及時(shí)補(bǔ)充液氮，防止液氮不足造成精液損失。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用Excel2010 整理處理之后， 采用SPSS22.0 相關(guān)性進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

有表1 可知， 原精液精子活力最高可達(dá)到99%最低90%，說(shuō)明原精精子活力好； 采精量平均192.55mL， 最高采精量264.5mL，最低采精量80mL；精子重平均7.24g，最高20g，最低2.64g；精子密度平均1.97 億/mL，最高可達(dá)30 億/mL，最低0.5億/mL；豬冷凍精液解凍后精子活力平均是55%，最高解凍后精子活力可達(dá)72%，最低40%。

表1 影響豬冷凍精液各指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果（n=30）

根據(jù)表2 的結(jié)果可知， 豬冷凍精液解凍后精子活力與原精采精量、精子重、密度、活力的相關(guān)系數(shù)分別為-0.098、-0.05、-0.06、0.11， 通過(guò)數(shù)值可以看出豬冷凍精液解凍后精子活力與采精量、精子重、密度呈負(fù)相關(guān)，與原精活力呈正相關(guān)；豬冷凍精液解凍后精子活力與原精采精量、精子重、密度、活力顯著性數(shù)值分別為0.61、0.81、0.77、0.40 均不顯著（p＞0.05）。

表2 影響豬冷凍精液各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)采精量、精子重、密度、原精精子活力與凍精精子活力進(jìn)行了相關(guān)分析。 得到以下結(jié)論：豬冷凍精液解凍后精子活力與采精量、精子重、密度呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明精子活力受采精量、精子重和密度影響，但是影響不顯著，與原精活力呈正相關(guān)，說(shuō)明原精精子活力越好解凍后精子活力好； 但是與原精采精量、 精子重、密度、活力差異均不顯著（p＞0.05），表明豬冷凍精液解凍后精液精子活力與原精采精量、精子重、密度、活力之間關(guān)系不大，說(shuō)明對(duì)豬冷凍精液解凍后精子活力影響不大， 影響豬冷凍精液解凍后活力最主要因素是豬精液稀釋液、 精液冷凍方法以及解凍方式[5]，通過(guò)上述結(jié)論為更好地提升豬冷凍精液研究提供新的思路和依據(jù)。