舒晴,邵雨薇,2,田峻,楊亞南

(1. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,武漢 430071; 2. 武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院,武漢 430071;3. 華潤(rùn)武鋼總醫(yī)院中醫(yī)科,武漢 430080; 4. 武漢科技大學(xué)職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430000)

作為神經(jīng)科學(xué)的重要研究手段,應(yīng)用光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)進(jìn)行神經(jīng)環(huán)路的研究在近年來(lái)方興未艾,越來(lái)越多的神經(jīng)核團(tuán)及相關(guān)神經(jīng)元的功能被發(fā)現(xiàn)。 作為神經(jīng)環(huán)路研究中最基礎(chǔ)的一環(huán),核團(tuán)的定位注射的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。 但是,作為實(shí)驗(yàn)操作步驟的關(guān)鍵,一些復(fù)雜核團(tuán)的注射參數(shù)往往在文獻(xiàn)中只有簡(jiǎn)單的描述,其它學(xué)者進(jìn)行相關(guān)后續(xù)研究時(shí)容易走彎路。 孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)位于延髓背側(cè)、迷走神經(jīng)背核的背外側(cè),為孤束的止點(diǎn),在吻尾方向上形成Y 字形細(xì)胞柱,貫穿延髓全長(zhǎng)[1]。 其在顱骨表面的投影已經(jīng)超過(guò)了顱底,到達(dá)了第1、2 頸椎。 在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)告中,孤束核的定位及注射參數(shù)出現(xiàn)了一定的差異性[2-5]。 筆者通過(guò)深入解讀相關(guān)文獻(xiàn),并應(yīng)用不同注射參數(shù)進(jìn)行重復(fù)性注射,初步探索出大鼠孤束核定位注射的參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6 ～12 周齡SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠15 只,體重200 ～400 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2019-0010】。 實(shí)驗(yàn)操作在武漢大學(xué)中南醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(鄂)2015-0025】進(jìn)行,自由進(jìn)食飲水,12 h 明暗周期,動(dòng)物房溫度(22 ± 2)℃,相對(duì)濕度(50 ± 10)%,每天更換墊料、飲水、清洗大鼠飲水器。 動(dòng)物處理及飼養(yǎng)條件按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R 原則給予人道主義關(guān)懷,并遵照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》實(shí)施。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心經(jīng)倫理審查后施行(AUP Number：2019025 號(hào))。

1.1.2 試劑及儀器

小動(dòng)物麻醉用異氟烷(分析純,深圳市瑞沃德生命科技有限公司,批號(hào)：20160218),霍亂菌素亞單位B-488(Cholera Toxin Subunit B Alexa Fluor 488 Conjugate, CTB-488, No. C34775),霍亂菌素亞單位B-594(Cholera Toxin Subunit B Alexa Fluor 594 Conjugate, CTB-594, No. C34777),4%多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán))。

數(shù)顯腦立體定位儀(深圳瑞沃德),異氟烷小動(dòng)物麻醉系統(tǒng)(深圳瑞沃德),微量注射泵(蘭格Longer,TJ-4A/SL0107-1A),玻璃電極拉制儀(日本Narishige,PC-10),玻璃電極(美國(guó)SUTTER, No.BF120-60-10),微量進(jìn)樣器(上海高鴿,1 μL),腦定位儀專(zhuān)用大鼠麻醉面罩、定位針夾持器、麻醉誘導(dǎo)盒、顱鉆(鉆頭直徑0.5 mm);玻璃離子水門(mén)汀(上海新世紀(jì)齒科), 熒光顯微鏡(奧林巴斯,BX-53)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程的進(jìn)度,最終所有大鼠被分為垂直注射組(n=2)、Bregma 定位組(n=5)和Lambda定位組(n = 8),但各組大鼠不在同一時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 大鼠孤束核微量注射的方法

(1)微量注射器的制作

應(yīng)用玻璃電極拉制儀,應(yīng)用“一步法”拉制尖端直徑約100 μm 的玻璃電極注射針,在電極內(nèi)灌注石蠟油后與微量進(jìn)樣器連接并用熱膠固定保持密封性。

(2)進(jìn)針點(diǎn)及進(jìn)針角度

將麻醉好的大鼠固定在大鼠腦立體定位儀上。備皮,用剪刀剪開(kāi)皮膚、皮下組織,鈍性分離骨膜,暴露顱骨顯示人字縫和十字縫,用無(wú)菌干棉球擦干凈局部。 前后左右調(diào)平顱骨,保持前、后囟和后囟左右2.5 mm 均在同一平面。 根據(jù)《The Rat Brain：in Stereotaxic Coordinates (6thedition)》[6]確定參照點(diǎn),根據(jù)各組進(jìn)針?lè)椒ǖ牟煌_定進(jìn)針點(diǎn)及進(jìn)針角度,在進(jìn)針點(diǎn)用顱鉆鉆取0.5 mm 圓孔。

(3)微量注射

微量注射泵吸取CTB-594 或CTB-488 0.3 mL后,根據(jù)各組定位參數(shù)的不同注射0.26 mL 于定位點(diǎn),注射時(shí)間5 min,注射完成后保留5 min,拔針后用玻璃離子水門(mén)汀封閉進(jìn)針點(diǎn)再縫合傷口。 術(shù)后所有大鼠連續(xù)3 d 肌肉注射慶大霉素,根據(jù)大鼠與人的劑量換算方法[7],大鼠注射劑量為成人臨床給藥劑量(mg/kg)的6.3 倍。 注射完成后大鼠正常進(jìn)食進(jìn)水。

1.2.3 大鼠取材、切片及成像

術(shù)后3 d 大鼠4%多聚甲醛心臟灌注后取全腦,全腦于4%多聚甲醛溶液中后固定72 h,固定完成后放入25%蔗糖溶液中脫水。 全腦組織脫水完成后,取大鼠孤束核所在冠狀面行10 μm 冰凍切片。冰凍切片自然解凍后封片,在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 孤束核注射位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)位置

根據(jù)腦定位圖譜及相關(guān)文獻(xiàn)確定大鼠孤束核的中后部,由第四腦室脈絡(luò)叢(choroid plexus,chp)移行為中央水管(central canal,cc)后的切面為注射標(biāo)準(zhǔn)位置[8],對(duì)應(yīng)圖譜大鼠冠狀切面圖1A 中Figure 147(Bregma-13.68 mm) 至 圖1B 中Figure 157(Bregma-15.00 mm),見(jiàn)紅色標(biāo)記位置。

圖1 孤束核注射的標(biāo)準(zhǔn)位置Figure 1 Standard localization of microinjection in solitary nucleus

2 結(jié)果

2.1 以Bregma 和顱底為基準(zhǔn)點(diǎn)垂直于顱骨平面進(jìn)針無(wú)法注射至孤束核標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)

根據(jù)《大鼠腦定位圖譜》[6]以大鼠顱骨平面Bregma-13.5 mm 為進(jìn)針點(diǎn)進(jìn)針,分離大鼠顱骨平面外皮膚及皮下組織,發(fā)現(xiàn)Bregma-13.5 mm 所在位置已超過(guò)顱底,無(wú)法在大鼠顱骨上進(jìn)行打孔注射等實(shí)驗(yàn)操作。 改用沿著顱底前緣0.5 mm 進(jìn)針,進(jìn)針深度7.5 mm,注射CTB-594 0.26 mL。 冰凍切片顯示CTB 注射位點(diǎn)在脈絡(luò)叢所在冠狀切面約Bregma-13 mm 處(見(jiàn)圖2),說(shuō)明以Bregma 為基準(zhǔn)垂直注射,即使以顱底前緣為進(jìn)針點(diǎn)仍無(wú)法準(zhǔn)確注射至孤束核的標(biāo)準(zhǔn)位置。

圖2 以Bregma 和顱底為基準(zhǔn)點(diǎn)垂直于顱骨平面進(jìn)針示意圖及注射位置熒光Figure 2 Schematic diagram of needle insertion perpendicular to the skull plane based on Bregma and skull as reference points and the injection position of fluorescence

2.2 以Bregma 為基準(zhǔn)點(diǎn)以一定角度斜刺無(wú)法準(zhǔn)確注射至孤束核標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)

在選取顱骨底部進(jìn)針點(diǎn)直刺的情況下仍無(wú)法達(dá)到NTS 中后部,故改為斜刺。 通過(guò)三角函數(shù)的計(jì)算,以Bregma-14.5 mm 為垂直進(jìn)針點(diǎn)(在顱底后方),垂直注射深度為7.86 mm,實(shí)際斜刺進(jìn)針點(diǎn)為Bregma-11 mm,進(jìn)針角度為24°,通過(guò)三角函數(shù)計(jì)算出進(jìn)針深度為8.6 mm(圖3A)。 注射后切片觀察發(fā)現(xiàn),同樣的注射參數(shù),熒光標(biāo)記的位置仍有差異(圖3),甚至在同一體重下,冠狀切面的熒光標(biāo)記位置也有差異(表1)。

2.3 以Lambda 為基準(zhǔn)點(diǎn)以一定角度斜刺可以準(zhǔn)確注射至400 g 左右的大鼠孤束核

結(jié)果提示,以Bregma 為基準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行定位無(wú)法準(zhǔn)確注射到大鼠孤束核。 故本實(shí)驗(yàn)以Lambda 為基準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行定位。 以大鼠腦定位圖譜中Interaural 點(diǎn)與Lambda 點(diǎn)的位置關(guān)系及Lambda 點(diǎn)后方能夠進(jìn)行打孔的顱骨平面最佳位置為依據(jù),通過(guò)三角函數(shù)計(jì)算出進(jìn)針點(diǎn)位于Lambda-3.2 mm、中線雙側(cè)旁開(kāi)0.5～0.7 mm。 進(jìn)針斜刺角度向后24°、斜刺深度9.6 mm 為注射點(diǎn)(圖4C)。 將不同體重大鼠均以上述注射參數(shù)進(jìn)行注射。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),體重為266、357 g的大鼠熒光信號(hào)的位置位于延髓背側(cè)且未見(jiàn)到針痕,僅有少量強(qiáng)度很弱的熒光標(biāo)記。 體重為395、450、382 g 的大鼠腦均看到明顯的針痕及明亮的熒光,且至少一側(cè)的熒光標(biāo)記位于孤束核或孤束核稍上方位置。 說(shuō)明以Lambda 為基準(zhǔn)點(diǎn)以一定角度斜刺可以準(zhǔn)確注射至400 g 左右的大鼠孤束核。 (見(jiàn)表2 及圖4)

圖3 以Bregma 為基準(zhǔn)點(diǎn)以一定角度斜刺示意圖(A)及熒光定位圖(B, C, D)Figure 3 Schematic diagram of the oblique puncture at a certain angle with the Bregma as the reference point (A)and the injection position of fluorescence (B, C, D)

表1 大鼠以Bregma 為基準(zhǔn)點(diǎn)以一定角度斜刺注射后熒光標(biāo)記的位置Table 1 Position of the fluorescent marker after oblique injection at a certain angle with Bregma as the reference point

表2 以Lambda 為基準(zhǔn)點(diǎn)斜刺大鼠注射后熒光標(biāo)記的位置Table 2 Position of the fluorescent marker after oblique injection at a certain angle with Lambda as the reference point

圖4 以Lambda 為基準(zhǔn)點(diǎn)以一定角度斜刺的示意圖(C)及熒光定位圖(A,B,D)Figure 4 Schematic diagram of the oblique puncture at a certain angle with the Lambda as the reference point (C)and the the injection position of fluorescence (A, B, D)

3 討論

孤束核因包繞孤束而得名,孤束由迷走神經(jīng)、舌咽神經(jīng)及面神經(jīng)的內(nèi)臟初級(jí)傳入纖維組成, 最終止于孤束核[9]。 孤束核接受來(lái)自舌咽神經(jīng)、舌下神經(jīng)的味覺(jué)傳入纖維[10],并將該信息傳至臂旁核和延髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生味覺(jué)[11]。 另外,孤束核還接收來(lái)自頸動(dòng)脈體和主動(dòng)脈弓中壓力化學(xué)感受器的信息,通過(guò)傳出副交感神經(jīng)和交感神經(jīng)復(fù)合體調(diào)節(jié)血壓和心率[12]。 作為心肺傳入輸入的一級(jí)神經(jīng)核團(tuán),孤束核接收包括血液pH、血氧水平、周?chē)幕瘜W(xué)感受器,壓力感受器和肺拉伸受體等輸入,進(jìn)而調(diào)節(jié)呼吸[13]。 另外,孤束核還能夠接收來(lái)自外周的飽腹信號(hào)并傳遞至下丘腦的食欲調(diào)控神經(jīng)元,參與飽腹感的調(diào)節(jié),最終發(fā)揮調(diào)控食欲的作用[14]。 以上這些研究均說(shuō)明孤束核是中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與內(nèi)臟調(diào)節(jié)的重要核團(tuán),具有深入研究?jī)r(jià)值。

早期孤束核的定位注射實(shí)驗(yàn)中腦立體定位儀的應(yīng)用并不普遍,常常以寫(xiě)翮(calamus scriptorius,延髓背面作為第四腦室底的菱形窩的下端最狹窄部分)作為標(biāo)志點(diǎn)[2,15],隨后固定注射針后直接對(duì)著延髓進(jìn)行注射。 注射前需要分離頸后部軟組織并暴露延髓背面,這種注射方式的創(chuàng)傷性明顯高于腦立體定位儀通過(guò)顱骨打孔后注射。 但近年來(lái)仍有研究在應(yīng)用這種方法[3,16]。 另外,大部分文獻(xiàn)對(duì)NTS 注射過(guò)程進(jìn)行描述時(shí),均只描述出腦立體定位儀的參數(shù),參數(shù)均為Bregma 為基準(zhǔn)點(diǎn)前后軸(anterior-posterior, AP)-12.5 ～ AP-14.5 mm 不等[4-5,17]。 但實(shí)際情況下,AP-13.00 mm 向后的打孔位置已經(jīng)非常接近顱底區(qū)域,由于大鼠顱骨平面延伸到顱底后向頸椎方向有一定有角度的反折,所以AP-13.00 mm 以后的顱骨平面完全沒(méi)有空間再進(jìn)行垂直打孔注射的操作。 因此,要想利用腦定位儀在顱骨表面打孔進(jìn)行注射,只能通過(guò)一定角度向后斜刺才能到達(dá)NTS。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,沿著顱骨底部的前緣直刺,也只能將CTB 注射至第四腦室脈絡(luò)叢所在的冠狀切面,無(wú)法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的 NTS 注射點(diǎn)。

早在上世紀(jì)70 年代,就有學(xué)者對(duì)大鼠前后囟的間距進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)體重越大的大鼠前后囟間距越長(zhǎng)[18]。 但由于當(dāng)時(shí)研究的樣本量不大,所以無(wú)法對(duì)相同體重區(qū)間的大鼠前后囟距離進(jìn)行有效統(tǒng)計(jì)。 另外,Bregma 的不穩(wěn)定性早有報(bào)道,特別是在Wistar 大鼠上表現(xiàn)明顯[19]。 基于這種不穩(wěn)定性,有學(xué)者提出用新的方法來(lái)確定其位置,可以提高定位注射或埋置電極的穩(wěn)定性[20]。 如2.2 結(jié)果所示,由于孤束核處于后腦,且未成年大鼠的前后囟距離并不穩(wěn)定,這也是導(dǎo)致注射位點(diǎn)偏淺的一個(gè)重要原因。 另外,Bregma 選擇的誤差可能也是注射位點(diǎn)過(guò)于遠(yuǎn)離中心點(diǎn)的原因之一。

在大鼠腦定位圖譜第6 版[6]中,顱骨表面的定位點(diǎn)包括兩個(gè)基準(zhǔn)點(diǎn)：前囟點(diǎn)(Bregma)和內(nèi)耳點(diǎn)(Interaural)。 Bregma 為大鼠顱頂冠狀縫和矢狀縫的相交點(diǎn),呈現(xiàn)十字型,因?yàn)轶w表定位清楚,為最常用的基準(zhǔn)點(diǎn)。 Interaural 為兩耳道連線的中點(diǎn),但無(wú)法在顱骨表面進(jìn)行直接定位,故選擇Lambda 點(diǎn)作為后腦區(qū)定位的基準(zhǔn)點(diǎn)。 Lambda 點(diǎn)位于人字縫(lambdoid suture)和矢狀縫的結(jié)合處后方,是人字縫最佳擬合曲線的中點(diǎn)。 另外,標(biāo)準(zhǔn)圖譜的大鼠體重為290 g,而成年大鼠(平均436 g)的Interaural 點(diǎn)位于Lambda 點(diǎn)后方約0.3 ～0.9 mm。 有學(xué)者通過(guò)統(tǒng)計(jì)235 項(xiàng)應(yīng)用了腦立體定位技術(shù)的研究,發(fā)現(xiàn)96%的實(shí)驗(yàn)中以Bregma 為基準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行注射,而且這些研究中,有35%的注射點(diǎn)與 Lambda 或Interaural 的距離比Bregma 更近[21]。 該統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明,雖然在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中以更近Lambda 為基準(zhǔn)點(diǎn)可能會(huì)讓注射部位更加精準(zhǔn),但是可能由于習(xí)慣性思維,絕大部分研究還是選擇Bregma 作為基準(zhǔn)點(diǎn)。 在實(shí)驗(yàn)三中,改用Lambda 作為后腦注射的基準(zhǔn)點(diǎn)以一定有角度斜刺。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),體重不到400 g 的大鼠注射后熒光位置均標(biāo)記在延髓與小腦的間隙,可能由于CTB 注射至腦干和延髓之間的縫隙,僅感染了腦干背部表面的神經(jīng)細(xì)胞,而400 g 左右的大鼠均可以準(zhǔn)確注射至NTS。 說(shuō)明即使應(yīng)用Lambda 作為后腦區(qū)核團(tuán)的注射點(diǎn),也可能因?yàn)榇笫蟮捏w重差異出現(xiàn)注射點(diǎn)的偏差,這一偏差可能與大鼠及其大腦的腦發(fā)育有關(guān)。 但是目前大鼠腦形態(tài)的發(fā)育和年齡的關(guān)系尚未發(fā)現(xiàn)有系統(tǒng)研究。 由于大鼠在10 ～11 周齡進(jìn)入性成熟期,體重在400 g 左右[22],我們推測(cè)以400 g 左右或以上的大鼠進(jìn)入成熟期后,顱骨及大腦的發(fā)育趨向于穩(wěn)定,更有利于注射的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性。 首先,大鼠腦立體定位儀沒(méi)有調(diào)節(jié)左右平衡的耳桿,操作過(guò)程中左右平面未調(diào)平會(huì)導(dǎo)致注射位點(diǎn)向一側(cè)偏移。 所以在進(jìn)行頭部固定的時(shí)候需要更加精準(zhǔn)的插入耳桿,以保持顱骨的左右水平。 其次,本次實(shí)驗(yàn)中所用大鼠總數(shù)量并不太多,但通過(guò)調(diào)整參數(shù)最終多次注射成功可以一定程度上說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性。第三,圖4 中注射成功的代表性圖片在實(shí)際操作中為雙側(cè)注射,400 g 以上大鼠至少能夠保證一側(cè)大鼠神經(jīng)元能夠被感染,并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 至于未成年大鼠的注射方法,則需要進(jìn)一步探索。

有學(xué)者通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)39%的研究并沒(méi)有對(duì)注射位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確性確認(rèn),也僅僅只有15%的研究指出在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有注射偏離正確位置的情況發(fā)生[21]。 我們通過(guò)挖掘文獻(xiàn)及進(jìn)行不同注射參數(shù)的反復(fù)試驗(yàn),在400 g 左右的大鼠中,以Lambda 為基準(zhǔn)點(diǎn)以一定角度斜刺可以準(zhǔn)確注射至大鼠孤束核。本實(shí)驗(yàn)的成功既能夠作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性確認(rèn)依據(jù),也能夠?yàn)槠渌枰M(jìn)行NTS 注射的實(shí)驗(yàn)提供一些基礎(chǔ)和線索。