楊真兒,劉 玲,張靜文,武 婧,金建文，王 川,3,史永恒,3,Waqas Khan(巴基斯坦),劉繼平△

1.陜西中醫(yī)藥大學藥學院(咸陽 712046)；2.陜西麗彩藥業(yè)有限公司(咸陽 712046)；3.陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機制與物質基礎重點研究室(咸陽 712046)

在女性生殖系統(tǒng)中，卵巢主要功能是規(guī)律性地生成卵泡并在卵泡成熟后排出，以及分泌雌激素和孕激素[1]，維持女性的月經(jīng)和生殖功能。卵巢儲備功能的高低，主要是看卵巢儲備的卵泡數(shù)量的多少以及質量的好壞，這兩項指標也側面表達了女性生育功能的潛能[2]。目前西醫(yī)針對卵巢儲備功能低下(Decreasing ovarian reservation,DOR)的治療方法主要是激素治療，多以雌激素類藥戊酸雌二醇配避孕藥黃體酮建立人工周期[3]，用來增補與 DOR 相關的激素缺乏，輔以誘導排卵、免疫抑制劑治療等[4]，是針對患者水平下降的激素進行相對的補充。卵巢儲備功能下降在中醫(yī)上可歸為 “血枯”“經(jīng)水早斷”“閉經(jīng)”等疾病范疇[5]。《沈氏女科輯要·月事不來》：“《金匱》言婦人經(jīng)水不來之化，分三大綱；積冷，氣結兩者，皆血滯不行，于法宜通，冷者溫經(jīng)行血?！睆堉倬罢J為閉經(jīng)之病因是“陰虛、積冷、結氣”。女性的月經(jīng)、生殖與氣血、脾腎功能緊密相連，治療也圍繞健脾益氣、滋陰養(yǎng)血展開。

丹歸膠囊由黨參、黃芪、當歸、枸杞子、丹參5味中藥組成，具有益氣補血、祛斑調(diào)經(jīng)的作用，用于氣血兩虧所致的月經(jīng)后期，黃褐斑或月經(jīng)后期伴黃褐斑；可見月經(jīng)色淡質稀、神疲乏力、少氣懶言、面色蒼白、頭暈眼花、舌質淡胖或有齒印、脈細無力。本課題組采用環(huán)磷酰胺制備大鼠卵巢儲備功能低下模型，評估丹歸膠囊的改善作用并探討其機制。

材料與方法

1 動物模型 體重約220～250 g的12周齡健康SPF級別SD雌性大鼠48只，成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學中藥藥理實驗室，動物分籠飼養(yǎng)，光照周期設置成12 h，自由進食、飲水。分組：健康SD雌性大鼠48只，有正常的動情周期，適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為六組：空白組、環(huán)磷酰胺組(模型組)，丹歸膠囊低、中、高劑量組(0.2、0.4、0.8 g/kg)，坤泰膠囊組(0.6 g/kg)，每組8只。除空白組外的其余五組，均腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，劑量為75 mg/kg(14 d成模)[6]，空白組給予等體積的生理鹽水。在造模的同時，給予坤泰膠囊和高、中、低劑量的丹歸膠囊，連續(xù)灌胃36 d。

2 藥物試劑與主要儀器 丹歸膠囊(國藥準字 Z20040084,0.3 g/粒，3粒/次，2次/d)：取出膠囊內(nèi)粉劑，用蒸餾水配成濃度為 0.15 g/ml 的溶液待用；坤泰膠囊(國藥準字 Z20000083，0.5 g/粒，4粒/次，3次/d)：用蒸餾水將囊內(nèi)藥粉配成0.25 g/ml 濃度的溶液待用。注射用環(huán)磷酰胺(200 mg/支，國藥準字:H32020857)，用 0.9 %生理鹽水配成濃度為 20 mg/ml 待用。

卵泡刺激素(雅培，批號：88473UI01)，雌二醇(雅培，批號：95176UI00)，促黃體生成素(雅培，批號：93241UI01)，AMH(抗穆勒試管激素)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(艾萊薩生物科技上海有限公司，批號：EIA-3083)； GDF-9(Affbiotech公司，貨號：DF7069)，Egr-1(WanleibioHRP 公司，貨號：WL00344 )，標記山羊抗兔IgG(ThermoFisher公司，貨號：#31460)，蘇木精(Solarbio公司，貨號：H8070)，山羊血清(Solarbio公司，貨號：SL038)，PBS 緩沖液(HyClone公司，貨號：SH30256.01B)，蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin HE)試劑盒(Wanleibio公司，貨號： WLA051a)。

化學發(fā)光儀(雅培，i4000SR)，全自動酶標儀(UR1T-660)，BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，水平搖床(北京六一公司)，雙垂直蛋白電泳儀(北京六一公司)，凝膠成像系統(tǒng)(北京六一公司)，顯微鏡(BX53，OLUMPUS公司),石蠟切片機(RM2235,Leica德國)，熒光定量 PCR 儀(Exicycler 96，BIONEER公司)，顯微鏡拍照系統(tǒng)(DP73，OLUMPUS公司)。

3 實驗方法

3.1 大鼠行為學、動情周期變化：記錄大鼠的活動量、進食量及進水量、體重等數(shù)據(jù)。在第5～14天和第27～36天期間，每日用一次性醫(yī)用棉簽蘸取濃度4%的磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer saline,PBS)，插入大鼠陰道內(nèi)輕輕旋轉取大鼠陰道分泌物，涂抹于載玻片上，HE 染色，記錄組別及編號，樹脂封片，靜置陰涼通風處干燥后于光鏡下觀察大鼠陰道上皮細胞的變化。

3.2 檢測大鼠激素水平變化:采用ELISA 法檢測性激素AMH水平，酶聯(lián)免疫法檢測性激素FSH、LH、E2水平。

3.3 卵巢、子宮組織的質量測定及卵巢組織形態(tài)學變化:用精密電子天平將解剖取出的雌性大鼠的卵巢及子宮分別進行稱重并記錄數(shù)據(jù)。用配制的4 %多聚甲醛固定液固定半數(shù)卵巢組織(其余用作PCR檢測)。進行乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片機切片 2 μm，脫蠟后 HE 染色，樹膠封片，晾干后于光鏡下觀察其形態(tài)學變化。

3.4 免疫組化法測大鼠卵巢GDF-9(生長分化因子-9)、Egr-1(早期生長反應因子-1)蛋白表達:將固定好的組織流水沖4 h后乙醇梯度脫水：70 %(2 h)、80 %(過夜)、90 %(1 h)、95 %(1 h)、100 %Ⅰ(20 min)、100 %Ⅱ(20 min)。放入二甲苯中至標本透明(30 min)。透蠟、包埋，切片5 μm于溫水皿中展開，移到載玻片上，60 ℃烘箱烘2 h，脫蠟至水?？乖迯?，3 % 過氧化氫孵育，山羊血清封閉。用PBS稀釋一抗完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)4 ℃ 過夜，取出后浸泡PBS 5 min，重復3次。HRP標記二抗用PBS稀釋500倍完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)37 ℃ 孵育60 min，浸泡 PBS 5 min，重復3次。等量混合DAB顯色試劑A、B，切片滴加100 μl顯色試劑，觀察顏色剛變深快速放在水中終止反應。 HE 復染，脫水、透明、封片，鏡檢?？贵w稀釋比例見表1。

表1 卵巢組織相關蛋白抗體和稀釋比例

3.5 采用Real Time PCR法檢測大鼠卵巢中TNF-α mRNA、INF-γ mRNA轉錄水平的變化情況:向樣本中加入1 ml TRIpure 裂解液，充分混勻，室溫下靜置5 min；向上述溶液中加入200 μl氯仿，上下顛倒混勻，室溫下靜置3 min；4 ℃ 10000 g離心10 min，樣品分成3層：黃色的有機相，中間層和無色的水相，將其中的水相移到新的離心管中；加入異丙醇(與水相等體積)顛倒混合均勻，-20 ℃條件下過夜；15 h 后，4 ℃10000 g離心10 min，棄上清；加入1 ml 75 %乙醇，4 ℃3400 g離心3 min，棄上清；室溫下靜置 5～6 min，讓殘余的乙醇揮發(fā)；加30 μl RNase-free ddH2O，室溫放置2 min，充分混勻，待其沉淀完全溶解，所得到的即為樣本的總 RNA。使用紫外分光光度計NANO 2000 檢測各樣本中RNA的濃度。利用 PCR 儀將得到的 RNA樣本進行反轉錄得到 cDNA，最后得到20 μl cDNA樣本。反應體系：cDNA模板1 μl；上下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μl；SYBR GREEN mastermix 10 μl；用ddH2O補足至20 μl。Realtime PCR 反應:應用兩步法反應程序，預變性94 ℃ 5 min、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s；然后40個循環(huán)反應:72 ℃ 2 min 30 s、40℃ 1 min 30 s。卵巢組織細胞因子引物序列見表2。分析方法利用2-△△ CT方法。

表2 卵巢組織各細胞因子引物序列

結 果

1 大鼠行為學及動情周期變化 見表3?？瞻捉M大鼠皮毛白凈有光澤感，精力充沛，進食飲水量正常，體重逐步增加。模型組大鼠精神狀態(tài)低迷，疲懶不愛動，皮毛干燥無光澤，喜喝水厭食，大便稀，體重較之前減輕。丹歸膠囊組和坤泰膠囊組大鼠隨著給藥天數(shù)增多，各種情況逐漸好轉，體重漸長。

表3 各組大鼠動情周期變化比較

空白組的發(fā)情周期大致為5 d，紊亂率為 0；所有模型組大鼠均出現(xiàn)延期現(xiàn)象，為9～10 d，紊亂率為100%，與空白組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。丹歸膠囊高、低劑量組紊亂率均為 37.50%，中劑量組紊亂率為 25.00%，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2 大鼠血清AMH水平和放射免疫分析法測LH、FSH、E2水平 見表4。與空白組比較，模型組大鼠血清中 FSH、LH明顯升高，E2、AMH 明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹歸膠囊三組大鼠血清 FSH、LH 明顯降低，E2、AMH 明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明丹歸膠囊可以降低因DOR導致的FSH、LH的異常升高，并促進E2、AMH的分泌，改善內(nèi)分泌激素紊亂，以達到改善卵巢功能的目的。

表4 各組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH含量比較

3 大鼠卵巢組織形態(tài)學變化 空白組大鼠新鮮卵巢呈淡紅色且富有彈性，各級卵泡形態(tài)均可見卵泡[7](原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡)，卵泡數(shù)量較多且飽滿，血管分布廣；模型組大鼠卵巢灰白色，卵泡數(shù)相對減少，閉鎖卵泡多；丹歸膠囊低、中劑量組大鼠卵巢外觀淡粉色，卵泡數(shù)量較模型組有所增多但不及空白組，卵泡正常，可見各級形態(tài)；丹歸膠囊高劑量組大鼠卵巢外觀粉紅色，卵泡數(shù)量較正常水平少，可見各級卵泡形態(tài)(圖1)。

圖1 大鼠卵巢組織形態(tài)學變化(HE 染色，×200)

4 各組大鼠GDF9、Egr-1蛋白的表達 見表5(圖2)。模型組大鼠較空白組卵巢中GDF-9、 Egr-1蛋白表達均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；丹歸膠囊低、中、高劑量組大鼠卵巢中GDF-9、Egr-1蛋白表達升高，以丹歸膠囊高劑量組最明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；坤泰膠囊組較模型組大鼠卵巢中GDF-9、 Egr-1蛋白表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠卵巢GDF-9、Egr-1 蛋白表達比較

圖2 大鼠卵巢組織GDF-9、Egr-1蛋白的表達(SP染色，×400)

5 各組大鼠卵巢 TNF-α mRNA、INF-γ mRNA的表達 見表6。與空白組相比，模型組大鼠卵巢中TNF-α mRNA、INF-γ mRNA表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組比較，坤泰膠囊組大鼠卵巢中TNF-α mRNA、INF-γ mRNA表達均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，丹歸膠囊低、中、高劑量組大鼠卵巢中TNF-α mRNA、INF-γ mRNA表達有不同程度的降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明丹歸膠囊可能是通過調(diào)控TNF-α mRNA、INF-γ mRNA的表達來達到抑制炎癥，保護卵巢組織功能的作用。

表6 各組大鼠卵巢組織TNF-α mRNA、INF-γ mRNA表達比較

討 論

卵巢儲備功能下降是指女性在四十歲前出現(xiàn)卵泡數(shù)量減少、卵母細胞質量下降，危害女性生殖健康甚至不育。但 DOR 的病因尚不明確，目前認為可能與遺傳因素、酶缺乏、促性腺激素及其受體異常、自身免疫損傷[8]、卵巢破壞性因素(放療、化療、手術、感染等)、 抑制素異常、卵泡生成障礙、卵細胞儲備過少或耗竭過多[9]以及心理因素、社會及家庭因素、生理因素及個體差異等有關[10]。中醫(yī)理論認為，女子以血為本，脾能統(tǒng)攝血液，因此脾為女性衰老論治之重點[11]。脾損傷則生化不足，氣血枯耗無力推動血行。脾氣虛久必及腎，脾腎陽虛，不能溫養(yǎng)，以致經(jīng)閉不行、宮寒。陳修園《女科要旨》中說：“雖曰，心生血，肝藏血，沖任督三脈俱為血海，為月信之源，而其統(tǒng)主則惟脾胃”。說明氣血充沛，脾胃、沖任調(diào)和，才能維系女性月經(jīng)、生殖健康[12]。而丹歸膠囊中黨參能補益脾胃，運化精微，滋生陰血，有補氣生血之效。黃芪，歸脾、肺經(jīng)，具補氣升陽，補脾益肺，益氣生血之功。枸杞為輔藥，既能補肝腎之陰，又有養(yǎng)血之功[13]，藥性平和。當歸質潤味辛性溫，既能養(yǎng)血調(diào)經(jīng)又能活血行氣。丹參具有很好的養(yǎng)血和血的功效。因此，丹歸膠囊治療DOR具有良好的健脾益氣、補氣養(yǎng)血的功效。

評估卵巢功能的常用指標是FSH、LH、E2及 AMH。主要由于卵巢除產(chǎn)生卵細胞外，還合成和分泌多種雌激素和孕激素[14]。雌激素中 E2的含量最高且活性最強，主要是促進女性生殖器官正常發(fā)育并維持女性生理特征，對女性的月經(jīng)、懷孕有著巨大的影響。FSH、LH是直接作用卵巢皮層的促性腺激素，用于調(diào)節(jié)卵巢功能。卵巢功能衰退時，卵泡數(shù)量和雌激素的同時減少可徑直引發(fā) FSH 和 LH 升高，遏制卵泡和卵子的生長發(fā)育，嚴重影響卵巢功能[15]。但 FSH、 LH、 E2會隨著月經(jīng)周期而變動,而AMH任何時間的濃度都一樣穩(wěn)定。AMH指數(shù)越高，說明卵子的庫存量越大，生育能力自然就較強；AMH指數(shù)降低時，就代表著卵巢正在老化，即女性生育力的衰退[16]。

本實驗結果顯示，丹歸膠囊能夠改善大鼠的精神不振，活動度差，皮毛無光澤等外在變化，表明丹歸膠囊可以改善卵巢儲備功能低下所導致的情志抑郁、形體消瘦等癥狀；丹歸膠囊可以調(diào)節(jié)卵巢儲備功能低下大鼠紊亂的內(nèi)分泌，降低其 FSH、LH 并升高E2、 AMH，提高卵巢儲備功能；丹歸膠囊能夠修復 DOR 大鼠受損的卵巢組織，使成熟卵泡增多，其中以丹歸低劑量和丹歸中劑量組效果最佳；丹歸膠囊能夠降低卵巢儲備功能低下大鼠卵巢中 TNF-α mRNA、INF-γ mRNA轉錄水平并提高GDF-9、Egr-1蛋白的表達，改善卵巢儲備功能。

綜上所述，對女性的卵巢儲備功能下降歸于脾胃失調(diào)、氣血兩虛。丹歸膠囊能健脾益氣、補氣養(yǎng)血，降低性激素 FSH、LH，升高 E2及AMH的水平，降低TNF-α mRNA、INF-γ mRNA轉錄水平，提高GDF-9、Egr-1蛋白的表達，改善卵巢儲備功能低下患者的卵巢儲備功能。