孫清榮，關秋竹，陶吉寒，孫洪雁

（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

果樹作物的離體葉片不定芽再生是體細胞誘變、外源基因遺傳轉(zhuǎn)化及無性系變異研究的基礎，是利用生物技術創(chuàng)制新種質(zhì)、培育突破性品種的基礎。離體葉片不定芽再生研究已在很多種果樹品種上獲得了成功［1-7］，梨樹的不定芽誘導研究在很多品種上也有成功報道［8-11］。

但不同品種間，其再生難易、再生途徑不同，對應的誘導培養(yǎng)基及獲得的不定梢再生率及不定梢生長表現(xiàn)等都存在較大差異。

庫爾勒香梨是新疆梨系統(tǒng)中最具代表性和特色的優(yōu)良品種。因梨果香氣濃郁、皮薄肉細、汁多渣少等特點，深受消費者的喜愛。但香梨存在果型不整、不抗腐爛病、抗寒性較低、產(chǎn)量不穩(wěn)定、品質(zhì)下降等問題，影響了香梨的生產(chǎn)和銷售，亟需進行品種改良和優(yōu)化。體細胞誘變和遺傳轉(zhuǎn)化是加速品種改良的有效育種途徑。體細胞誘變和遺傳轉(zhuǎn)化方法應用的前提是離體葉片高效不定芽再生體系的建立。關于庫爾勒香梨離體葉片不定芽再生研究雖有報道［11，12］，但存在再生率較低和可重復性較差的問題。本研究的目的是提高庫爾勒香梨的離體葉片不定芽再生率及可重復性，克服不定芽玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生，提高不定芽再生的應用效果，為利用生物技術改良這一品種奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山東省果樹研究所組織培養(yǎng)室繼代繁殖保存的庫爾勒香梨試管苗。

1.2 試驗方法

從繼代增殖生長4周的試管苗頂端切取展開或微展開的幼嫩葉片，根據(jù)葉片大小橫切3～5刀，接種到裝有不定芽誘導培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)。每瓶接種10片葉，每處理接種3瓶，計30片葉，算作一個重復，重復3次。葉片接種后先連續(xù)暗培養(yǎng)3周，然后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。培養(yǎng)至7周時統(tǒng)計產(chǎn)生不定芽的葉片數(shù)并計數(shù)每片葉的不定芽數(shù)，計算葉片不定芽再生率及平均單位葉片不定芽數(shù)。

葉片不定芽誘導培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基為NN69，碳源為蔗糖和D-山梨醇，細胞分裂素為BA（3 mg／L，5 mg／L）和 TDZ（1 mg／L，2 mg／L），共組成8種處理（見表1），每一處理都添加0.3 mg／L NAA。

1.3 統(tǒng)計分析

采用DPS v7.5分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用最小顯著差異（LSD）法進行不同處理間差異顯著性比較分析。

2 結果與分析

2.1 碳源對離體葉片再生不定芽的影響

2.1.1 碳源對葉片不定芽再生率的影響 在細胞分裂素相同的條件下，總體上表現(xiàn)D-山梨醇比蔗糖作碳源更有利于提高不定芽再生率，D-山梨醇作碳源的平均再生率（70.2%）明顯高于蔗糖的（55.7%）；但平均每葉不定芽數(shù)兩種碳源之間無明顯差異，D-山梨醇上平均每葉不定芽數(shù)為1.74個，蔗糖上為1.65個（表1）。

細胞分裂素為BA時，D-山梨醇作碳源的不定芽再生率顯著高于蔗糖的（表1）。細胞分裂素為TDZ時，在較低濃度（1 mg／L）時，D-山梨醇和蔗糖處理之間無顯著差異；在較高濃度（2 mg／L）時，D-山梨醇處理顯著高于蔗糖處理。以D-山梨醇作碳源、添加細胞分裂素BA時，庫爾勒香梨的不定芽再生率較高，在添加5 mg／L BA的培養(yǎng)基上再生率最高，達96.3%。

2.1.2 碳源對不定芽生長的影響 以D-山梨醇作碳源比蔗糖作碳源誘導產(chǎn)生的不定芽（梢）玻璃化率高（圖1 A，B，C，D），最高達60.8%（表1）；以蔗糖作碳源的不定芽再生率雖然低于D-山梨醇，但誘導產(chǎn)生的不定芽（梢）玻璃化率低，均在10%以下（表1），正常健壯不定芽（梢）居多（圖1 E，F(xiàn)，G，H）。其次，D-山梨醇作碳源還誘導產(chǎn)生只有葉片但沒有明顯生長點的異常不定芽（圖1 I）。

表1 碳源和細胞分裂素對庫爾勒香梨葉片再生不定芽（梢）的影響

圖1 庫爾勒香梨離體葉片不定芽（梢）生長表現(xiàn)

綜合比較不定芽的再生率和玻璃化率，蔗糖作為誘導庫爾勒香梨離體葉片再生不定芽的碳源要優(yōu)于D-山梨醇。

2.2 細胞分裂素對庫爾勒香梨葉片再生不定芽的影響

2.2.1 細胞分裂素對不定芽再生率的影響 庫爾勒香梨離體葉片不定芽（梢）再生率，兩種碳源上都表現(xiàn)細胞分裂素BA顯著高于TDZ（表1），表明誘導庫爾勒香梨離體葉片不定芽（梢）再生BA比TDZ有效。碳源為D-山梨醇時，BA不同濃度間及TDZ不同濃度間的再生率都無顯著差異。碳源為蔗糖時，TDZ較低濃度（1 mg／L）處理的不定芽再生率顯著高于較高濃度（2 mg／L）處理，而BA不同濃度間差異不顯著。平均每葉不定芽數(shù)，依據(jù)碳源的不同，BA和TDZ表現(xiàn)也不同。當碳源為D-山梨醇時，BA和TDZ之間差異不顯著；當碳源為蔗糖時，平均每葉不定芽數(shù)BA處理顯著高于TDZ處理。在蔗糖和5 mg／L BA組合的誘導培養(yǎng)基上，平均每葉不定芽數(shù)最多，為2.2個（表1）。

2.2.2 細胞分裂素對不定芽伸長生長的影響不受供試碳源種類和細胞分裂素濃度的影響，BA誘導的不定芽在誘導培養(yǎng)基上可直接伸長生長形成不定梢（圖1 A，B，E，F(xiàn)）；而 TDZ誘導的不定芽，除了1mg／L TDZ和蔗糖組合培養(yǎng)基上可直接伸長生長形成不定梢（圖1 H）外，其余TDZ處理僅能誘導出不定芽（圖1 C，D，H），需轉(zhuǎn)移到不加TDZ的生長培養(yǎng)基上才能繼續(xù)生長形成不定梢（資料沒列出）。表明，BA比TDZ更易誘導不定梢的形成，BA誘導的不定芽不需更換培養(yǎng)基一步培養(yǎng)就可獲得不定梢，而TDZ誘導的不定芽需要兩步培養(yǎng)才能形成不定梢。

綜合不定芽再生率及不定芽生長表現(xiàn)，本研究得出誘導庫爾勒香梨離體葉片不定芽再生的最適宜碳源為蔗糖，適宜的細胞分裂素為BA。

3 討論與結論

碳源種類對庫爾勒香梨離體葉片不定芽再生率及其生長表現(xiàn)都有重要影響。對不定芽再生率，山梨醇比蔗糖有效，誘導獲得的不定芽再生率高；但對不定芽的生長表現(xiàn)，蔗糖優(yōu)于山梨醇。這一結果與山梨醇對蘋果砧木離體葉片再生不定梢的研究結果不同［5］，山梨醇能明顯提高蘋果砧木‘54-118’的葉片不定梢再生率，且不定梢健壯；而本研究中D-山梨醇雖然誘導庫爾勒香梨葉片獲得了較高的不定芽再生率，但不定芽玻璃化率也高，不是期望的健康不定芽，應用價值小。這表明基因型不同，適宜的碳源也不同，應根據(jù)不同基因型篩選其適宜的碳源。

細胞分裂素BA和TDZ對梨離體葉片不定芽再生的影響因品種不同而不同［13，14］。野生西洋梨的葉片不定芽再生，BA比TDZ有效［13］，西洋梨品種‘紅考密斯’葉片不定梢再生，BA比TDZ有效［9］，‘中梨1號’葉片的不定芽再生，TDZ比BA有效［14］。本研究中，BA比TDZ更有利于提高庫爾勒香梨不定芽再生率和促進不定芽的伸長生長，與鐘穎等［11］報道的TDZ誘導庫爾勒香梨葉片不定芽再生率達84.9%的研究結果不一致，這可能是由于基本培養(yǎng)基和再生途徑的不同所致。本研究的基本培養(yǎng)基為NN69，再生途徑為直接誘導再生不定芽；而鐘穎等的研究所用基本培養(yǎng)基為1／2MS，再生途徑為先誘導愈傷，再由愈傷誘導不定芽，不定芽再生周期較長，不是最佳誘導方法。對‘金花’梨，BA和TDZ誘導的葉片不定梢再生率沒有顯著差異，但對‘鴨梨’，BA能成功誘導不定芽再生，而 TDZ不能誘導不定芽再生［8］。綜上所述，雖然TDZ的細胞分裂活性比BA高，但在誘導葉片不定芽再生上，TDZ并不適宜所有品種，應針對不同品種篩選其適宜的細胞分裂素種類及濃度，才能達到最佳再生效果。