武晏屹田 碩苗明三

(河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450000)

黃褐斑又稱“妊娠斑”、“肝斑”、“黧黑斑”、“蝴蝶斑”等[1],由于皮膚黑色素的增加,形成褐色或黑色斑點(diǎn),是一種色素沉著性、損容性皮膚病,多發(fā)于面部,尤以眼眶、兩頰、額部、口角等處最為常見[2]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,雖無明顯不適,但對患者的容貌、生活質(zhì)量等有較大的影響[3]。 在多因素影響下,黃褐斑的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[4],雖治療方法多樣,仍欠缺有效手段,是臨床上典型的易診難治性疾病。 黃褐斑理論研究、新藥篩選、中醫(yī)療法研究,與黃褐斑動物實(shí)驗(yàn)的開展息息相關(guān),故成功復(fù)制動物模型、選擇適宜的給藥方式及時間、合理檢測相關(guān)指標(biāo)是順利進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)的必備條件。 同時文獻(xiàn)計(jì)量既能體現(xiàn)學(xué)科定量化的趨勢,又有助于科研人員了解相關(guān)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀[5],故本文以數(shù)據(jù)挖掘?yàn)橹饕侄?以“黃褐斑”為主題,檢索中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫中關(guān)于黃褐斑的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn),對已開展的黃褐斑模型應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述、分析,為黃褐斑實(shí)驗(yàn)研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 文獻(xiàn)篩選

1.1.1 檢索標(biāo)準(zhǔn)

以“黃褐斑”為主題,檢索中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫中關(guān)于黃褐斑的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn),時間范圍分別為“1960-2019、1990-2019、1979-2019”。 文獻(xiàn)來源為“全部期刊”。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

為動物實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

排除臨床研究文獻(xiàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物用藥、臨床用藥舉偶或臨床驗(yàn)方、研究進(jìn)展等文獻(xiàn)；重復(fù)的動物實(shí)驗(yàn)研究報導(dǎo)只納入一次。

1.2 方法

詳細(xì)閱讀文獻(xiàn),對文獻(xiàn)中涉及的實(shí)驗(yàn)動物品種、模型復(fù)制方法、造模時間、給藥方式及時間、指標(biāo)檢測等逐一輸入Excel 2013 建立數(shù)據(jù)庫,進(jìn)一步對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析并繪制相關(guān)圖形進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)用概況

在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,以主題為“黃褐斑”,時間范圍分別為“1960-2019、1990-2019、1979-2019”,文獻(xiàn)來源為“全部期刊”共篩選出104 篇黃褐斑動物實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn),在復(fù)制動物模型時,以大鼠、小鼠、豚鼠最為常見,以小鼠應(yīng)用居多,占52.88%；其次為豚鼠,占比35.58%。 其中尤以 KM 小鼠應(yīng)用最多,占比44.23%,詳情見表1。 此外,在動物性別的選擇上也有顯著差異,其中82.69%文獻(xiàn)選用雌性動物,僅有13.46%的文獻(xiàn)選用雄性動物。

表1 黃褐斑模型實(shí)驗(yàn)動物品種分布表Table 1 Experimental animal models of chloasma

2.2 模型復(fù)制方法概況

2.2.1 造模方法

目前常用的黃褐斑的造模方法大致可分6 種:黃體酮全身攻擊、紫外線照射、黃體酮全身攻擊聯(lián)合紫外線照射、紫外線照射聯(lián)合雌二醇局部涂抹、紫外線照射聯(lián)合束縛,以及可在聯(lián)合造模的基礎(chǔ)上增加動物慢性束縛來制備肝郁氣滯型黃褐斑模型。通過分析納入的104 篇實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn),以紫外線照射最為常用(43.27%),其次為采用黃體酮全身攻擊聯(lián)合紫外線照射的方法復(fù)制模型(28.85%),詳情見表2。

再次，對城建稅、教育費(fèi)附加、地方教育費(fèi)附加、水利建設(shè)基金進(jìn)行分析。商業(yè)銀行應(yīng)當(dāng)以增值稅額為計(jì)稅基礎(chǔ)，申報繳納附加稅費(fèi)。

在使用紫外線復(fù)制模型時,紫外線波長全部在275～320 nm 之間,屬于中波紫外線,以320 nm 應(yīng)用最多,占58.02%。 紫外線的照射時長與模型是否成功密切相關(guān),其照射時間多在20～60 min 之間,最短為每天照射30 s,最長為60 min。 其中以照射60 min 最為常見,占37.04%,詳情見圖1。

在黃體酮全身攻擊時,所選用動物品種的不同,其肌肉注射的量也有區(qū)別,大鼠(3 篇)黃體酮注射量常用劑量為25 mg/kg,小鼠(29 篇)常用劑量為20 mg/kg；豚鼠(4 篇)常用劑量為20 mg/kg,最大劑量達(dá)到100 mg/kg。

2.2.2 造模時間

黃褐斑是一種慢性、獲得性色素增加性皮膚病,故無論采用何種造模方法,造模時間相對較長,以30 d 最為常見(48.08%),最長可達(dá)60 d,最短不少于7 d 成模,詳情見表3。

2.3 給藥及時間

臨床上主要采用中藥內(nèi)服及外用、針灸等方法治療黃褐斑,分析納入的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)可知,其給藥方法主要涉及灌胃、局部外用、局部激光照射或配合激光導(dǎo)入藥物、皮下注射及針灸等。 其給藥方式也可分為造模后給藥、造模前給藥、邊造模邊給藥, 其中造模后給藥應(yīng)用相對較多(54.81%),詳情見表4。 在驗(yàn)證療效的過程中,常以臨床上公認(rèn)的藥物為陽性對照藥,其中內(nèi)服給藥 多 選 用 維 生 素 C (25.96%)、 百 消 丹 等(3.85%)；外用給藥則以氫醌乳膏(18.27%)應(yīng)用最多,此外也有文獻(xiàn)采用氨甲環(huán)酸注射液、壬二酸等。 無論外用還是內(nèi)服,其給藥時間大多分布在28 ～31 d(58.65%),最長給藥56 d,最短為脈沖照射等,僅給藥1 次,詳情見表5。

表2 黃褐斑造模方法統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical analysis of chloasma modeling methods

2.4 實(shí)驗(yàn)相關(guān)檢測指標(biāo)概況

對于黃褐斑指標(biāo)的檢測,可分為表觀指標(biāo)、生化指標(biāo)、病理指標(biāo),此外也有文獻(xiàn)對動物血液流變學(xué)特點(diǎn)的變化進(jìn)行檢測。 不同的指標(biāo)從表觀、微觀及分子生物角度分析藥物的作用效果及相關(guān)作用機(jī)制。 所分析的文獻(xiàn)中,有75.96%對動物皮膚、血清或肝中的相關(guān)生化指標(biāo)進(jìn)行分析；75.00%的文獻(xiàn)對病變局部皮膚狀況進(jìn)行微觀定性或定量分析；僅有33.65%的文獻(xiàn)對皮膚局部的表觀狀態(tài)進(jìn)行積分統(tǒng)計(jì)分析。 詳情見圖2。

圖1 紫外線照射時間分布圖Figure 1 UV exposure time

表3 黃褐斑模型造模時間統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical analysis of the duration of chloasma model experimental periods

2.4.1 表觀指標(biāo)

表觀指標(biāo)可直觀、清晰的反映藥物對黃褐斑的療效, 在療效的判斷中占有重要地位[6]。 有33.65%的文獻(xiàn)對動物局部皮膚進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì),主要觀察皮膚是否出現(xiàn)紅斑、增厚、脫屑、干燥、點(diǎn)狀斑塊、皮膚變硬、結(jié)痂、曬傷等情況,并對色斑面積、色斑顏色進(jìn)行積分統(tǒng)計(jì)。

病理是診斷的金標(biāo)準(zhǔn),可從微觀角度反映具體條件下疾病的本質(zhì),揭示組織異質(zhì)性,反映組織病理生理學(xué)的微觀變化,可進(jìn)一步揭露局部變化[7-8]。有75.00%的文獻(xiàn)通過HE 染色、Masson-Fontana 染色及免疫組化等方法對局部皮膚情況進(jìn)行定性、定量分析。 對局部皮膚中黑色素細(xì)胞數(shù)目、脂褐質(zhì)的含量、黑色素顆粒的面積、基底細(xì)胞層黑色素的沉著情況等進(jìn)行定量分析；對表皮層中角化層是否增厚、膠原纖維是否變性、是否有炎癥細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管是否增多等情況進(jìn)行定性分析。

2.4.3 生化指標(biāo)

生化指標(biāo)則能夠從分子水平反映病癥變化,是組織、器官機(jī)能狀態(tài)變化的一個重要指標(biāo),同時能夠進(jìn)一步揭露藥物作用機(jī)制。 已有的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)對生化指標(biāo)的檢測共可分為3 個方面:血清、皮膚勻漿、肝勻漿。

皮膚為黃褐斑病灶局部,其指標(biāo)變化可揭示證型和微觀量化之間的某種聯(lián)系,可更加準(zhǔn)確的反應(yīng)局部病灶的病變情況及愈合情況,為探討藥物局部作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。 已有的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)中,有75.96%的文獻(xiàn)測量皮膚勻漿中相關(guān)生化因子,共涉及20 種生化因子,其中以測量皮膚勻漿中的超氧化物歧化酶、丙二醛最為常見。

表4 給藥方式分布表Table 4 Types of drugs administered

表5 給藥時長分布表Table 5 Duration of drug administration

中醫(yī)認(rèn)為黃褐斑病在皮,其病在內(nèi),與機(jī)體整體功能狀態(tài)密切相關(guān),從其發(fā)病機(jī)制來看,多與機(jī)體內(nèi)分泌失調(diào)、氧化與抗氧化失衡等有關(guān),故在判斷療效及探討機(jī)制時,也常以血清中相關(guān)指標(biāo)的變化來反應(yīng)整體療效與機(jī)制。 已有的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)中,有30.61%的文獻(xiàn)測量血清中相關(guān)指標(biāo),包括氧化功能相關(guān)指標(biāo)超氧化物歧化酶、丙二醛等,內(nèi)分泌相關(guān)指標(biāo)雌二醇、睪酮、孕酮等。

黃褐斑在中醫(yī)學(xué)上又稱“肝斑”,其疏泄功能異常是導(dǎo)致黃褐斑發(fā)病的主要原因。 此外,肝作為性激素結(jié)合球蛋白的主要合成場所,參與性腺激素的合成、轉(zhuǎn)化和滅活；肝也是生物體內(nèi)重要的氧化還原反應(yīng)場所[9],而氧化還原失衡及內(nèi)分泌是黃褐斑主要的發(fā)病因素,故肝功能的調(diào)節(jié)在黃褐斑的發(fā)生、發(fā)展、加重上起著至關(guān)重要的作用。 已有的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)中,有34.69%的文獻(xiàn)涉及肝勻漿中相關(guān)生化因子的測量,主要包括超氧化物歧化酶、丙二醛、酪氨酸酶等。 詳情見表6。

3 討論

黃褐斑是一種色素代謝障礙性皮膚病[10],與內(nèi)分泌失調(diào)、紫外線照射、皮膚屏障功能障礙、氧化與抗氧化失衡等密切相關(guān)[11-14],目前治療黃褐斑的方法包括口服預(yù)防紫外線輻射、局部增白劑、化學(xué)換膚、光療法和激光療法等[15]。 從中醫(yī)角度來講,黃褐斑以血脈不通為標(biāo),面部及體表色素沉著為主癥,與肝、脾、腎三大臟器息息相關(guān),此外黃褐斑與血瘀密切相關(guān),素有“有斑必有瘀,無瘀不成斑”之說[16]。 故中醫(yī)常以瘀、肝、脾、腎、肺論治[17-20],采用穴位注射、中藥面膜、或聯(lián)合舒肝顆粒進(jìn)行治療[21-22],也有學(xué)者根據(jù)月經(jīng)周期不同時期陰陽、氣血的變化規(guī)律,采用周期序貫的療法[23]。 此外也有采用中西醫(yī)結(jié)合如口服紅花逍遙片聯(lián)合外用氫醌乳膏等方法[24]。 雖臨床上治療黃褐斑的方法多樣,但其效果不盡人意,仍是典型的易診難治性疾病,且療程綿長,易反復(fù)[25]。 故尋找安全、高效的治療方法仍是各醫(yī)家不斷努力的方向,而動物實(shí)驗(yàn)是探討黃褐斑理論知識、探究新療法、研制新藥物的基礎(chǔ),打好動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),可提高治療黃褐斑的科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性、安全性。

圖2 黃褐斑相關(guān)指標(biāo)檢測概況Figure 2 Overview of the detection of chloasma-related indicators

表6 黃褐斑動物模型檢測指標(biāo)分布表Table 6 Index of animal models of chloasma

黃褐斑動物模型的建立至今無國內(nèi)外公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)[26],本文通過分析中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫中黃褐斑相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),黃褐斑實(shí)驗(yàn)研究性文獻(xiàn)僅有104 篇文獻(xiàn),與黃褐斑的高發(fā)病率、高波及率、易診難治性、易復(fù)發(fā)性有較大出入。 在模型復(fù)制方面,目前尚未發(fā)現(xiàn)與黃褐斑發(fā)病過程完全相同的動物自發(fā)性黃褐斑模型,在實(shí)驗(yàn)研究中多采用鼠類動物進(jìn)行復(fù)制,目前選用的實(shí)驗(yàn)動物主要有KM小鼠、豚鼠等。 鼠類動物與人類皮膚結(jié)構(gòu)相近,且廉價易得,是復(fù)制黃褐斑模型的理想動物。 小鼠以其皮膚角化程度較低、皮膚及角質(zhì)層厚度較小[27],更易受到紫外線照射的影響,且廉價易得,容易飼養(yǎng)[28-29],是研究者的首選動物。 此外,豚鼠皮膚結(jié)構(gòu)與厚度與人的皮膚極為相似[30],其皮膚黑色素細(xì)胞和黑色素體的分布形態(tài)與人類更為相似[31],但其飼養(yǎng)成本相對較高、對飼養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格,指標(biāo)檢測相關(guān)的抗體相對不足[32-33],因此其應(yīng)用頻率僅次于KM 小鼠。 結(jié)合黃褐斑在臨床上具有顯著的性別差異[34],女性雌、孕激素變化水平明顯較男性活躍,故而發(fā)病率較高,因此在實(shí)驗(yàn)研究中多選用雌性實(shí)驗(yàn)動物,以更加貼近臨床實(shí)際。

復(fù)制黃褐斑動物模型主要是通過增加機(jī)體黑色素的產(chǎn)生及沉著,導(dǎo)致黃褐斑的形成。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)目前已有的實(shí)驗(yàn)研究中,以單純的紫外線照射復(fù)制黃褐斑模型最為普遍,其操作簡便,模型成功率較高,基本符合黃褐斑臨床癥狀,但結(jié)合黃褐斑發(fā)病機(jī)制及影響因素,單純紫外線照射與發(fā)病過程存在較大差異,因此該方法更加適合藥效評價性實(shí)驗(yàn)。 黃體酮注射液+紫外線照射法結(jié)合內(nèi)分泌因素與紫外因素,更加貼近黃褐斑多因素致病發(fā)病過程,是黃褐斑發(fā)病機(jī)制及藥物作用機(jī)制研究的較理想模型。 在紫外線波長的選擇中,多采用中波紫外線(275～320 nm),能夠增加黑色素細(xì)胞的受體活性,其中以320 nm 最為常見；不同動物照射時間略有差異,小鼠皮膚角質(zhì)層相對較薄,照射時間可適當(dāng)縮短,豚鼠、大鼠則可適當(dāng)延長,但一般集中在30-60 min 左右；不同動物黃體酮注射量也有一定差異,大鼠常注射25 mg/kg,小鼠及豚鼠的注射量則集中在20 mg/kg。 造模時間以30 d 最為常見,最短不少于7 d。 其給藥方式以造模后給藥應(yīng)用相對較多,該給藥方式更加符合臨床實(shí)際。 此外,黃褐斑屬于慢性皮膚病,病程相對較長,給藥時間大多分布在28～31 d。 在陽性對照藥的選擇上,內(nèi)服給藥以維生素C 較為常見,外用則以局部涂抹氫醌乳膏為多。 在指標(biāo)的測量中,僅有33.65%的文獻(xiàn)涉及表觀指標(biāo)的分析,表觀指標(biāo)是對藥效的直觀反映,應(yīng)在藥效評價中占有重要地位；75.96%的文獻(xiàn)以生化指標(biāo)為主,側(cè)重于皮膚、血清、肝勻漿中的超氧化物歧化酶、丙二醛等氧化相關(guān)指標(biāo)含量的變化,現(xiàn)代研究分析,黃褐斑的發(fā)病與內(nèi)分泌的失衡密切相關(guān),但僅6 篇文獻(xiàn)涉及激素相關(guān)指標(biāo),并以探討血清中含量的變化為主；71.43%的文獻(xiàn)涉及局部皮膚病理變化的檢測,通過定量與定性觀察,從微觀角度評價藥物療效及潛在作用機(jī)制。

綜上分析,對黃褐斑的實(shí)驗(yàn)研究及理論探討與黃褐斑發(fā)病現(xiàn)狀嚴(yán)重失衡,未來應(yīng)增加動物實(shí)驗(yàn)研究,以進(jìn)一步明確黃褐斑的發(fā)病機(jī)理、藥物療效及作用機(jī)制,為臨床研究提供確鑿的理論依據(jù)。 在模型復(fù)制方面,已有的模型制備方法缺乏中醫(yī)致病因素的干預(yù),缺少不同證型的黃褐斑動物模型建立方法,因此建立復(fù)合動物模型、具有中醫(yī)病癥特點(diǎn)的動物模型是未來重要的研究方向。 目前對藥物作用機(jī)制的研究僅局限于體內(nèi)、體表氧化與抗氧化失衡,忽略內(nèi)分泌失調(diào)等相關(guān)因素。 此外,大量理論探討及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),黃褐斑與體內(nèi)NEI 網(wǎng)絡(luò)的紊亂密切相關(guān)[35],隨著體表NEI 網(wǎng)絡(luò)的提出與深入研究,皮膚作為人體最大的器官,同樣存在著分泌、代謝黃褐斑相關(guān)生化因子,具備相應(yīng)的受體,如α-黑色素細(xì)胞刺激素、白介素-1,白介素-6、一氧化氮、孕酮、雌二醇等[36],故在黃褐斑的治療中,是否通過調(diào)節(jié)體內(nèi)、體表NEI 網(wǎng)絡(luò)而發(fā)揮整體、局部療效可能是未來重要研究方向,值得進(jìn)一步深入探討。