黃 劍馬曉彤張亞杰李麗靜韓 冬劉 佳

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,長(zhǎng)春 130117)

心力衰竭又叫充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF),現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,CHF 是心臟無(wú)法滿足機(jī)體代謝所需要的血量進(jìn)而引起的以循環(huán)功能障礙為主要表現(xiàn)的臨床綜合征,包含身體多個(gè)方面改變,最終出現(xiàn)心功能失代償,出現(xiàn)心力衰竭的癥狀[1]。 CHF 屬于中醫(yī)證候中的心腎陽(yáng)虛證,其具有本虛標(biāo)實(shí)的特點(diǎn),表現(xiàn)為脾氣虛、肺氣虛、腎氣虛和肝氣虛,以水停血瘀、陽(yáng)虛水泛為發(fā)病機(jī)制,以上表現(xiàn)屬《傷寒論》中的真武湯證,應(yīng)以真武湯加以治療。 臨床研究表明真武湯可以輔助西藥進(jìn)行慢性心力衰竭治療,可以輔助西藥逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu),提高心臟供血能力,改善心力衰竭患者心功能[2-3]。 因此,本實(shí)驗(yàn)依據(jù)真武湯對(duì)心肌的保護(hù)作用,通過(guò)注射阿霉素建立心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠模型,研究大鼠接受真武湯前后對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠行為體征、血流動(dòng)力學(xué)以及相關(guān)自噬過(guò)程中蛋白表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康2 月齡SPF 級(jí)SD 雄性大鼠70 只,體重260～280 g 購(gòu)自遼寧省長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)-2016-0001]。 甲狀腺切除手術(shù)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室[SYXK(吉)2016-0017]進(jìn)行。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及操作流程嚴(yán)格遵守3R 原則,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(20190051)。 動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室,室溫為25℃,相對(duì)濕度為50%～70%,飼喂大鼠維持飼料,自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

注射用鹽酸多柔比星(161108),購(gòu)置于山西普德藥業(yè)股份有限公司；芪藶強(qiáng)心膠囊(20160412),購(gòu)置于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；大鼠BNP、LA、CaN、TSH、T3、T4 試劑盒購(gòu)置于上海源葉生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、一抗二抗去除液、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、Western 洗滌液、SDS-PAGE 電泳液(干粉)、 ECL 發(fā) 光 液 購(gòu) 置 于 中 國(guó) wanleibio；LC3( WL01506 )、 BECLIN 1 ( WL02508 )、 P62(WL02385)、ATG5(WL02411)、羊抗兔IgG-HRP(WLA023)、內(nèi)參抗體β-actin(WL01372)購(gòu)置于中國(guó)wanleibio；辣根酶標(biāo)記鏈酶親合素購(gòu)置于中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊血清、DAB 顯色液購(gòu)置于中國(guó)Solarbio。

電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(上海飛鴿儀器廠)；酶標(biāo)儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)；水平搖床(北京六一)；電泳裝置(北京六一)；凝膠成像系統(tǒng)(北京六一)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司)；顯微鏡(日本OLUMPUS 公司)；16 道生理記錄儀(美國(guó)Biopac 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模及分組

腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)麻醉大鼠,BL-420F 生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或II 導(dǎo)聯(lián)心電圖[4],篩選并棄去ST 段有異常變化者和心律失常者。 本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立,參考中醫(yī)證候心腎陽(yáng)虛證以及吳向東[5]用大鼠建立的該種證候動(dòng)物模型并改進(jìn)。 取符合要求的健康SPF 級(jí)的雄性SD 大鼠70 只,隨機(jī)分為正常組(Control,10 只)、模型組(CHF,60 只)。 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg),麻醉后摘除雙側(cè)甲狀腺。 空白對(duì)照組行假手術(shù)。 術(shù)后第15 天起,模型組大鼠尾靜脈注射鹽酸阿霉素(4 mg/kg),空白對(duì)照組注射等劑量生理溶液,每周注射1 次,持續(xù)5 周。 術(shù)后第35 天將存活下來(lái)模型組動(dòng)物再次隨機(jī)分為5 組,即模型對(duì)照組(CHF)、芪藶強(qiáng)心膠囊組(QL,0.37 g/kg)、真武湯高劑量組(ZWG,1.35 g/kg)、真武湯中劑量組(ZWZ,0.81 g/kg)、真武湯低劑量組(ZWD,0.41 g/kg)各12 只。 次日灌胃相應(yīng)藥物,空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃蒸餾水,連續(xù)10 d。

1.3.2 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠一般情況影響

給藥后每周測(cè)定大鼠體溫、體重,詳細(xì)記錄進(jìn)食數(shù)量和飲水情況。

1.3.3 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心臟指數(shù)的影響

稱取大鼠體重,處死后,迅速取出心臟組織,以生理鹽水清洗,稱取心臟重量,公式如下:CWI=大鼠心臟重量/大鼠體重×100%。

1.3.4 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠血流動(dòng)力學(xué)影響

第10 天給藥完畢30 min 后,打開(kāi)已定標(biāo)好的十六道生理記錄儀及軟件后,以20%烏拉坦0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠,通過(guò)十六導(dǎo)系統(tǒng),觀察并記錄各組左室最大上升速率(+dp/dtmax)、左室最大下降速率(-dp/dtmax)等指標(biāo)的變化情況。

1.3.5 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠血清T3、T4和TSH 含量影響

大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,平均麻醉劑量為30 mg/kg,等待大鼠被麻醉后,用手術(shù)剪切開(kāi)動(dòng)物的腹腔,迅速地剪斷股動(dòng)脈,進(jìn)行采血,最后分離血清,使用大鼠T3、T4、TSH 的ELISA 試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)測(cè)定大鼠血清中T3、T4、TSH 含量[6]。

1.3.6 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌細(xì)胞BNP、LA 和CaN 含量影響

取心肌組織,加入適量的蛋白萃取劑,心肌組織標(biāo)本勻漿化。 300 r/min,離心20 min。 收集上清。 同上述檢測(cè)方法類似,經(jīng)過(guò)稀釋、加樣、溫育、洗滌等步驟,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸分析計(jì)算濃度。

1.3.7 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌LC3、ATG5、P62 蛋白表達(dá)影響

稱取心肌組織,通過(guò)全蛋白提取試劑盒(中國(guó)wanleibio) 進(jìn)行組織勻漿,低溫離心(4℃,12000 r/min,10 min)分離上清得到蛋白質(zhì)抽提物。 通過(guò)BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)wanleibio)測(cè)定蛋白含量。 加入20 μL 樣品并在10%及15%聚丙烯酰胺凝膠上分離。 轉(zhuǎn)印至PVDF 膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h,用相應(yīng)的抗體探測(cè)。 使用對(duì)應(yīng)的免疫球蛋白試劑通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B 型,北京六一)觀察印跡,用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer 軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.3.8 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌組織LC3 和P62 表達(dá)影響

固定后的心肌組織依次進(jìn)行包埋、透蠟、切片、抗原包被等程序,封片后于顯微鏡40×10 觀察染色效果并拍照。

1.3.9 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌組織病理變化的影響

固定后的心肌組織進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片、染色等程序,封片后于顯微鏡40×10 下觀察染色效果并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,進(jìn)行多組間差別用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),組間兩兩比較用方差分析后的LSD 檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,檢驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01 為統(tǒng)計(jì)學(xué)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠一般情況影響

2.1.1 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠自然情況影響

各給藥組和模型對(duì)照組比較狀態(tài)較好,活動(dòng)較自如,癥狀有了明顯改善,飲食、飲水基本恢復(fù)正常,皮毛相對(duì)柔順而略有光澤,顏色由黃變淡,體重下降不明顯,精神狀態(tài)良好,較為活潑好動(dòng),生命體征總體好于模型對(duì)照組,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.2 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠體重、體溫的影響

CHF 大鼠在造模后,體重下降趨勢(shì)顯著,與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),雖然芪藶強(qiáng)心膠囊和真武湯高中劑量可以改善體重的降低,但并無(wú)明顯差別(P＞0.05)。 體溫也隨著靜脈注射阿霉素時(shí)間的增加有所下降,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.3 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心臟指數(shù)的影響

與空白組相比,心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠心臟心臟指數(shù)雖有所增加,但無(wú)明顯變化(P＞0.05),結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

血流動(dòng)力學(xué)方面,模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較±dp/dpmax 變化十分明顯(P＜0.01),+dp/dpmax下降至空白對(duì)照組值的35.5%,說(shuō)明造模成功[7]。芪藶強(qiáng)心膠囊和真武湯各劑量都能夠顯著抑制±dp/dpmax 變化(P＜0.05),說(shuō)明真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠心肌的收縮和舒張功能均有明顯改善作用,結(jié)果如表4。

2.3 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠血清T3、T4、TSH 含量的影響

除空白組外,T4的含量均較低(P＜0.05),說(shuō)明甲狀腺清除完整,各給藥組可提高血清中T4含量,證明各給藥組可以改善心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠甲狀腺功能；造模后大鼠血清TSH 的含量高于空白組(P＜0.05)。 證明造模后甲狀腺功能降低,機(jī)體需要通過(guò)增加TSH 來(lái)刺激T4產(chǎn)生。 結(jié)果見(jiàn)表5。

2.4 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌BNP、LA、CaN 含量的影響

與正常組比較,心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌組織LA 水平有所降低(P＜0.05),CaN、LA 含量有所升高(P＜0.05),而各給藥組均可對(duì)三個(gè)指標(biāo)具有不同程度調(diào)節(jié)作用,其中高劑量組作用最強(qiáng)(P＜0.05 或P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)表6。

表1 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠自然情況影響(n=10)Table 1 Physiological state of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表2 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠體重、體溫的影響(,n = 10)Table 2 Body weight and temperature of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表2 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠體重、體溫的影響(,n = 10)Table 2 Body weight and temperature of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05Note.Compare with model group, *P＜0.05.

組別Groups體重(g)Weight體溫(℃)Body temperature正常組Control 304.43±17.78* 38.47±0.17模型對(duì)照組CHF 248.40±32.80 37.42±0.50芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 275.24±57.30* 37.08±0.62真武湯高劑量組ZWG 248.67±32.01* 37.00±0.33真武湯中劑量組ZWZ 251.62±56.30* 36.97±0.66真武湯低劑量組ZWD 209.61±19.33* 37.45±1.18

表3 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠心臟指數(shù)的影響(,n=10)Table 3 Cardiac index of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表3 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠心臟指數(shù)的影響(,n=10)Table 3 Cardiac index of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05。Note.Compare with model group, *P＜0.05.

組別Groups劑量Dose心臟指數(shù)(g/kg)CWI正常組Control —— 2.6726±0.2064模型對(duì)照組CHF —— 2.8408±0.7152芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 g/kg 2.8143±0.3638真武湯高劑量組ZWG 1.35 g/kg 2.9043±0.1667真武湯中劑量組ZWZ 0.81 g/kg 3.3972±0.1171*真武湯低劑量組ZWD 0.41 g/kg 3.0415±0.3002

表4 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)影響(,n=10)Table 4 Hemodynamics of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表4 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)影響(,n=10)Table 4 Hemodynamics of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/kg)Dose左室最大上升速率(mmHg/s)+dp/dtmax左室最大下降速率(mmHg/s)-dp/dtmax正常組Control —— 5234.86±187.02** -5219.60±194.21**模型對(duì)照組CHF —— 1859.85±163.13 -1764.93±182.27芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 3786.41±181.17** -3577.87±128.38**真武湯高劑量組ZWG 1.35 2943.28±153.96** -2839.27±173.52**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 2441.53±149.23* -2521.64±160.86*真武湯低劑量組ZWD 0.41 2236.41±110.46 -2377.87±128.38

2.5 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白的影響

Western blot 結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,心腎陽(yáng)虛模型CHF 大鼠心肌LC3、ATG5、BECLIN1 水平明顯降低,而各給藥組均能提高大鼠心肌組織中LC3、ATG5、BECLIN1 蛋白表達(dá)量。 與對(duì)照組比較,心腎陽(yáng)虛模型CHF 大鼠心肌P62 水平變化不大,但各給藥組均能降低P62 蛋白表達(dá)量,其中真武湯各組降低作用明顯,結(jié)果見(jiàn)圖1,由左至右依次為正常組,模型對(duì)照組,芪藶強(qiáng)心膠囊組,真武湯高、中、低劑量組,詳見(jiàn)表7。

表5 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠血液中T3、T4、TSH 的影響(,n = 10)Table 5 T3, T4, TSH of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表5 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠血液中T3、T4、TSH 的影響(,n = 10)Table 5 T3, T4, TSH of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05。Note.Compared with the model group, *P＜0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose三碘甲腺原氨酸T3(nmol/L)血清總甲狀腺素T4(nmol/L)促甲狀腺激素TSH(nmol/L)正常組Control — 0.04±0.01 0.75±0.09* 0.68±0.16*模型對(duì)照組CHF — 0.05±0.01 0.51±0.01 0.80±0.12芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 0.05±0.02 0.55±0.00* 0.82±0.09*真武湯高劑量組ZWG 1.35 0.05±0.01 0.57±0.02* 0.85±0.17真武湯中劑量組ZWZ 0.81 0.04±0.02 0.55±0.05* 0.83±0.19真武湯低劑量組ZWD 0.41 0.03±0.01 0.53±0.00* 0.83±0.19

表6 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠血液中LA、CaN、BNP 的影響(,n=10)Table 6 LA, CaN, BNP of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表6 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠血液中LA、CaN、BNP 的影響(,n=10)Table 6 LA, CaN, BNP of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/kg)Dose乳酸LA(nmol/L)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶CaN(nmol/L)腦鈉肽BNP(nmol/L)正常對(duì)照組Control - 16.96±0.76* 1.35±0.30* 1.07±0.22*模型對(duì)照組CHF - 16.30±0.37 1.83±0.29 1.31±0.22芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 17.96±1.88* 1.45±0.30* 0.91±0.38*真武湯高劑量組ZWG 1.35 16.85±0.70* 1.33±0.29** 0.96±0.25**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 16.57±0.57 1.49±0.25* 1.02±0.25**真武湯低劑量組ZWD 0.41 16.33±0.67 1.55±0.21* 1.26±0.24

表7 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白相對(duì)蛋白含量的影響(,n=10)Table 7 Autophagy related protein of heart-kidney yang deficiency CHF rats by ZW

表7 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白相對(duì)蛋白含量的影響(,n=10)Table 7 Autophagy related protein of heart-kidney yang deficiency CHF rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

組別Groups 劑量(g/kg)Dose LC3 ATG5 Beclin1 P62正常對(duì)照組Control - 1.00±0.00*** 1.00±0.00*** 1.00±0.00* 1.00±0..00*模型對(duì)照組CHF - 0.66±0.11 0.71±0.23 0.95±0.07 1.13±0.18芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 1.80±0.13*** 1.69±0.23*** 1.70±0.21*** 0.97±0.13*真武湯高劑量組ZWG 1.35 2.77±0.15*** 1.73±0.24*** 1.73±0.18*** 0.81±0.24**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 2.83±0.13*** 2.01±0.23*** 1.20±0.22** 0.68±0.16***真武湯低劑量組ZWD 0.41 2.52±0.12*** 2.02±0.28*** 1.73±0.14*** 0.81±0.17***

圖1 心肌組織LC3(a)、ATG5(b)、BECLIN1(c)、P62(d)表達(dá)結(jié)果Figure 1 Results of LC3 (a), ATG5 (b), BECLIN1 (c), P62 (d) in myocardial tissue

2.6 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌組織LC3 和p62 表達(dá)影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組心肌BECLIN1、P62 表達(dá)量降低,各給藥組可以升高心腎陽(yáng)虛型CHF 導(dǎo)致的P62 表達(dá)量的降低,見(jiàn)圖2。

2.7 真武湯對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌組織影響

HE 染色結(jié)果可見(jiàn):空白對(duì)照組心肌纖維間連接密集、纖維間分布平整,細(xì)胞與細(xì)胞之間距離正常；模型對(duì)照組心肌細(xì)胞邊緣不整,大面積心肌纖維溶斷,細(xì)胞間距加寬,心肌纖維排列混亂,存在局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,心肌組織產(chǎn)生局部水腫；各給藥組可使模型對(duì)照組的心肌細(xì)胞得到好的治療改善,結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 討論

慢性心力衰竭中醫(yī)證型分類方式繁多各有側(cè)重,目前還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 相對(duì)比較權(quán)威的《中醫(yī)新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]辯證標(biāo)準(zhǔn)將本病分為7 個(gè)證型。 疾病的初期病理變化是心肺氣虛。 病情進(jìn)一步進(jìn)展則是氣陰兩虧、氣虛血疲。 而慢性心力衰竭較嚴(yán)重的階段則是心腎陽(yáng)虛、陽(yáng)虛水泛、痰飲阻肺。 在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中,我們通過(guò)手術(shù)將實(shí)驗(yàn)用大鼠兩側(cè)甲狀腺切除,再對(duì)它進(jìn)行尾部靜脈注射阿霉素之后,實(shí)驗(yàn)大鼠主要表現(xiàn)出毛皮灰黃、呼吸微弱、精神萎靡、畏寒蜷縮、大便溏瀉的癥狀,這些生命體征與人類中醫(yī)證候心腎陽(yáng)虛證型非常相像[9]。 基源于此,我們認(rèn)為這組大鼠的表現(xiàn)與模擬的心腎陽(yáng)虛證候十分吻合,根據(jù)上述研究?jī)?nèi)容,我們?cè)诮⑿哪I陽(yáng)虛證的動(dòng)物模型時(shí),可以參考上述方案。

圖2 免疫組化檢查結(jié)果Note.A, Control.B, Model.C, QL.D, ZWG.E, ZWZ.F, ZWD.Compared with the model group, ***P＜0.001.Figure 2 Results of IHC

圖3 光鏡檢查結(jié)果Figure 3 Results by light microscopy

經(jīng)過(guò)大量的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),阿霉素在長(zhǎng)期應(yīng)用時(shí)可出現(xiàn)難以恢復(fù)的心臟毒性作用,而且由于阿霉素與心肌組織親和力顯著強(qiáng)于其他組織,因此可出現(xiàn)劑量不可逆的依賴性心肌損傷[10],可能與其機(jī)制相關(guān)的因素有:基因突變[10-11]；核酸、脂質(zhì)過(guò)氧化[12]；Ca2+超載[13]；能量代謝障礙[14-15]；自由基損傷[16]；產(chǎn)物的直接性損害[17]等。 目前,腹腔間斷性注射阿霉素已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于慢性心力衰大鼠模型的建立[18-19],并被認(rèn)為能夠高度模仿人體慢性心力衰竭的神經(jīng)-內(nèi)分泌機(jī)制和血流動(dòng)力學(xué)的改變,與其它造模方法相比,該法具有方法簡(jiǎn)單和復(fù)制性高的優(yōu)點(diǎn)。 因此本研究認(rèn)為尾靜脈注射阿霉素造成的心力衰竭模型能更好地用于益氣溫陽(yáng)抗心衰的治療性研究。

本研究結(jié)果顯示,真武湯可以降低心腎陽(yáng)虛型心力衰竭大鼠心肌組BNP 含量,說(shuō)明其對(duì)心衰癥狀具有改善功能。 LA 作為運(yùn)動(dòng)時(shí)物質(zhì)代謝的產(chǎn)物,模型動(dòng)物L(fēng)A 含量降低說(shuō)明心肌細(xì)胞功能下降,而真武湯能夠升高心肌組織LA 含量,降低CaN 含量,說(shuō)明真武湯能夠改善心臟能量代謝。 心腎陽(yáng)虛型CHF 大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白LC3、ATG5、BECLIN1含量降低,P62 含量升高,說(shuō)明心力衰竭初期心肌細(xì)胞有大量細(xì)胞發(fā)生自噬,真武湯可以升高心力衰竭大鼠自噬相關(guān)指標(biāo)LC3、ATG5、BECLIN1 含量,降低P62 含量,說(shuō)明真武湯在心力衰竭初期可以通過(guò)調(diào)節(jié)自噬保護(hù)損傷的心肌細(xì)胞。

綜上所述,在進(jìn)行有關(guān)針對(duì)心腎陽(yáng)虛型CHF 模型的構(gòu)建的研究時(shí),可以應(yīng)用阿霉素尾靜脈注射的方法,本研究認(rèn)為尾靜脈注射阿霉素造成的心力衰竭模型能更好地用于益氣溫陽(yáng)抗心衰的治療性研究,并且,在臨床中針對(duì)本有不同程度符合心腎陽(yáng)虛證型的慢性心力衰竭的患者,可以加以應(yīng)用真武湯進(jìn)行辨證論治。