李曉波付 瑞王 吉王淑菁王莎莎李 威秦 驍黃宗文賀爭鳴岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所,北京 102629)

自小鼠諾如病毒(murine norovirus, MNV)2003年由Karst 等人[1]發(fā)現(xiàn)以來,世界各地的報道表明其在實驗小鼠中有很高的感染率,并且各品系小鼠均對其易感[2-5],免疫功能正常的小鼠感染MNV 后大多無明顯臨床癥狀,但可持續(xù)通過糞便排毒長達數(shù)月[6],表明MNV 可在小鼠體內(nèi)長期存在,易造成實驗小鼠中的廣泛傳播。 國際上一些實驗動物權(quán)威監(jiān)管和檢測機構(gòu)已將其列為實驗小鼠需要常規(guī)監(jiān)測的病原體[7]。

MNV 感染致小鼠組織發(fā)生病理損傷的報道多集中在小鼠腸道疾病模型及免疫缺陷鼠,MNV 感染在不同的小鼠模型試驗中產(chǎn)生的臨床癥狀不相同,有的嚴重,有的幾乎觀察不到。 同樣,不同的小鼠實驗造成的組織損傷也有所不同,損傷的嚴重程度除了與不同的疾病模型有關(guān),還與所用病毒的毒株、感染時間、病毒接種途徑及其他實驗條件相關(guān)[8]。

已報道的發(fā)現(xiàn)病理損傷的組織最常見的是肝、其他還見于肺、脾、胃腸道及腸系膜淋巴結(jié)等[8],目前MNV 感染免疫功能正常小鼠病理損傷研究較少,所研究的品系有限,主要為129 小鼠[1,9-12]。

本文通過對實驗常用的KM,BALB/c,C57BL/6,NIH,BALB/c-nu 等品系的小鼠人工感染MNV,研究感染后不同的時間點各組織臟器的病理改變及核酸含量變化情況,探討MNV 感染對小鼠實驗可能存在的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

5 個品系SPF 級小鼠,分別為KM,BALB/c,NIH,C57BL/6 及BALB/c-nu,均為6 周齡,體重分別為KM 30～32 g,BALB/c 18～20 g,NIH 20 ～22 g,C57BL/6 16 ～18 g,BALB/c-nu 16 ～18 g,每個品系50 只,雌性,購自國家嚙齒類實驗動物種子中心[SCXK(京)2017-0005],經(jīng)檢測符合SPF 等級實驗動物國家標準且MNV 為陰性。 動物實驗于中國食品藥品檢定研究院屏障動物設(shè)施進行[SYXK(京)2017-0013],實驗所用鼠料、水及墊料等均經(jīng)滅菌處理,已通過中國食品藥品檢定研究院實驗動物福利倫理審查委員會審查(中檢動(福)第2018(B)020 號),按實驗動物的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 病毒株

小鼠諾如病毒 BJ10 - 2062 株(GenBank:KM458057),本實驗室分離并保存[13],TCID50為10-4.625/0.1 mL。

1.2 主要試劑與儀器

甲醛溶液(批號:20180104)購自國藥化學(xué)試劑公司；紅細胞裂解液(批號:R7218)購自天根生物；TaqMan Gene Expression Master Mix(批號:00701838)購自ABI 公司；RNeasy Mini Kit(批號:157034469)購自Qiagen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑(批號:0000310558)購自Promega；TB Green Premix Ex Taq GC、dNTP、無RNA酶水等購自TaKaRa。 熒光PCR 儀(ABI 7500 Fast)；生物組織包埋機(慧達HD-310)；切片機(MICROM HM315)；全自動染色機(Leica autostainer XL)；光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX51)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理

每個品系的動物隨機分為感染組和對照組,每組各25 只,參考文獻報道的劑量[10-11],感染組經(jīng)口灌胃0.2 mL MNV 病毒液(TCID50= 10-4.625/0.1 mL),對照組灌胃0.2 mL 生理鹽水。 每日觀察動物狀態(tài),分別在感染MNV 后第7,14,21,28,55 天于對照組和感染組各選取5 只小鼠,二氧化碳麻醉后取抗凝血,處死后立即取肝、脾、肺、小腸、盲腸、結(jié)腸等組織,每個組織取2 份,一份加入3 倍體積10%甲醛溶液固定,進行組織病理學(xué)診斷；另外一份組織取100 mg 加入900 μL 滅菌PBS,勻漿機充分勻漿,12000 r/min 離心5 min,取200 μL 上清進行組織核酸的提取。 取200 μL 抗凝血加入600 μL 紅細胞裂解液,顛倒混勻,室溫放置5 min,10000 r/min 離心1 min,吸去上清,余下沉淀加入200 μL 滅菌PBS,重懸后提取核酸。

1.3.2 病理學(xué)診斷:

步驟1.3.1 所取組織在甲醛溶液中固定1 周,每48 h 換一次固定液,后經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE 染色等步驟制備病理切片,在光學(xué)顯微鏡下進行觀察并采集數(shù)碼圖像。

1.3.3 組織MNV 核酸含量測定

步驟1.3.1 所取組織,勻漿機充分勻漿,12000 r/min 離心5 min,取200 μL 上清液提取RNA,先將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系包含5×RT buffer 5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)4 μL,隨機引物1 μL,逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL,RNA 模板8 μL,去RNA 酶水6.5 μL。 反應(yīng)條件:37℃90 min,72℃15 min,4℃5 min。 按參考文獻[14]報道的熒光定量PCR 法測定MNV 核酸含量,20 μL 的反應(yīng)體系包含TB Green Premix Ex Taq GC(2×)10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ROX reference dye II(50×)0.4 μL,待檢cDNA 2 μL,無RNA 酶水6.8 μL。 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃10 s,60℃30 s,共40 個循環(huán),每個循環(huán)結(jié)束采集熒光信號。 每次擴增設(shè)陽性對照和陰性對照,質(zhì)粒標準品由TaKaRa 合成,設(shè)5 個濃度,分別為1.1×103～1.1×107copies/μL,每個濃度做3 個平行,最后通過標準曲線進行定量。

1.3.4 結(jié)果分析

(1)比較各組織總的病理變化及核酸檢測情況。

(2)比較不同品系小鼠之間各組織病理改變情況及核酸含量。

(3)比較小鼠感染MNV 后不同時間各組織病理變化及核酸含量變化特點。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理改變分析

2.1.1 不同組織病理改變分析

從發(fā)生病理改變的組織分布來看,感染組中肝、脾、肺均發(fā)現(xiàn)有不同程度的病理改變,其中肝病變率最高,為8%(10/125),主要表現(xiàn)為血管邊緣大量胞核圓形堿性藍染的淋巴樣細胞聚集,伴有胞核桿狀的纖維細胞增生；管腔壁增厚,胞核扁平或三角狀的枯否氏細胞增多(圖1)。 脾病變率為5.6%(7/125),主要表現(xiàn)為脾小結(jié)數(shù)量減少(圖2)；肺病變率為4%(5/125),主要表現(xiàn)為肺細支氣管旁邊有較多的嗜堿性藍染的淋巴樣細胞浸潤(圖3),小腸、盲腸和結(jié)腸未發(fā)現(xiàn)病理變化(表1)。 對照組小鼠各組織均未發(fā)現(xiàn)病理改變。

2.1.2 不同品系動物病理改變分析

同一組織在不同品系小鼠的病理變化相似。KM 小鼠病變主要發(fā)生在肝和肺,發(fā)生率均為12%(3/25),脾為4%(1/25)；BALB/c 小鼠肝、脾和肺均發(fā)生病變的發(fā)生率僅為4%(1/25)；C57BL/6 小鼠發(fā)生病變的部位主要是肝和肺,病變率分別為8%(2/25)和4%(1/25),脾未發(fā)現(xiàn)病變；NIH 小鼠發(fā)生病變的組織集中在肝和脾,發(fā)生率均為12%(3/25),肺未發(fā)現(xiàn)病變；BALB/c-nu 小鼠肝和脾有病變發(fā)生,發(fā)生率分別為4%(1/25)和8%(2/25)。所有品系小鼠的腸道組織(盲腸、結(jié)腸和小腸)均未發(fā)現(xiàn)病理改變(表1)。

圖1 肝病理變化Note.A/B, Control group.C/D, Infection group.Figure 1 Pathological changes of liver

圖2 脾病理變化Note.A/B, Control group.C/D, Infection group.Figure 2 Pathological changes of spleen

圖3 肺病理變化Note.A/B, Control group.C/D, Infection group.Figure 3 Pathological changes of lung

2.1.3 感染MNV 不同時間病理改變分析

從病變發(fā)生的時間看,在感染MNV 第7 天,KM小鼠肝和肺各出現(xiàn)1 例病變；NIH 小鼠有1 例脾的脾小結(jié)數(shù)量減少；感染第14 天,KM 小鼠和NIH 小鼠各有1 例肝發(fā)生病變,BALB/c、NIH 及BALB/cnu 小鼠各有1 例脾發(fā)生病變；感染第21 天,KM、BALB/c、NIH 及BALB/c-nu 小鼠各有1 例肝病變,同時BALB/c 小鼠肺1 例,NIH 小鼠脾1 例發(fā)現(xiàn)病變；感染第28 天,KM 小鼠有2 例肺出現(xiàn)病變,NIH小鼠1 例肝,C57BL/6 小鼠1 例肺,BALB/c-nu 小鼠1 例脾發(fā)現(xiàn)病變。 感染第55 天,KM 小鼠1 例脾、C57BL/6 小鼠2 例肝發(fā)現(xiàn)病變,其余各品系無明顯病變。 綜上分析,KM 及NIH 小鼠發(fā)生病變較早,其次為BALB/c 和BALB/c-nu 小鼠,而C57BL/6 小鼠產(chǎn)生病變的時間較晚。

2.2 組織核酸的檢測

2.2.1 不同組織核酸的檢測

總體來看,盲腸、結(jié)腸MNV 核酸陽性率均為100%(125/125),其次為小腸,陽性率為71.2%(89/125)；各臟器中脾的陽性率最高,為39.2%(49/125)；肝陽性率為17.6%(22/125),肺的陽性率為3.2%(4/125),有2 份血樣檢出核酸陽性(2/125)。 陽性組織核酸含量相比,腸道含量較高,其中盲腸含量最高,其次為結(jié)腸及小腸；臟器含量較低,依次為脾＞肺＞肝。 對照組所有組織MNV 核酸均為陰性。

2.2.2 不同品系小鼠核酸含量的比較

比較不同品系小鼠各陽性組織MNV 核酸含量,各品系小鼠肝、脾、小腸、盲腸核酸含量無統(tǒng)計學(xué)差異；BALB/c-nu 小鼠結(jié)腸核酸含量顯著高于其他品系小鼠(P＜0.01)(表2)。

2.2.3 感染MNV 不同時間各品系組織核酸含量比較

經(jīng)單因素方差分析,C57BL/6 小鼠感染MNV第14 天盲腸MNV 核酸含量顯著高于其他時間(P＜0.05),第7、14 天結(jié)腸含量極顯著高于第28、55 天(P＜0.01)。 其余品系小鼠各組織MNV 核酸含量各個時間點之間無顯著差異(圖4)。

2.2.4 組織病變與MNV 核酸檢出率的關(guān)系

各組織病理與核酸檢測的結(jié)果統(tǒng)計見表3,結(jié)果表明405 份組織樣本病理檢查為陰性,而核酸檢測結(jié)果為陽性；13 份樣品病理檢查結(jié)果為陽性而核酸檢測結(jié)果為陰性,說明病理檢查與核酸檢測結(jié)果并不一致,兩者無相關(guān)性。

表1 感染組各組織病理及核酸檢測結(jié)果Table 1 Pathology and nucleic acid test results of infection groups

表2 不同品系小鼠各組織核酸含量(,copies/mg)Table 2 Nucleic acid content of different tissues

表2 不同品系小鼠各組織核酸含量(,copies/mg)Table 2 Nucleic acid content of different tissues

注:與其他品系比較,*P＜0.01。Note.Compared with other strains, *P＜0.01.

品系Strains肝脾Liver Lung盲腸Cecum結(jié)腸Colon小腸Small intestine KM 6.2±1.3 49.7±12.5 6510.6±788.9 1189.2±457.3 1985.4±139.8 BALB/c 3.7±0.9 40.1±10.9 7571.6±695.4 2355.4±583.7 1245.9±152.3 C57BL/6 4.0±1.2 44.9±8.9 7881.8±865.9 2291.1±614.1 1872.2±168.5 NIH 6.1±1.2 39.0±5.3 5864.0±588.0 1965.8±763.7 1031.8±111.2 BALB/c-nu 4.6±1.3 37.8±7.0 6462.7±653.1 9370.0±894.4* 1238.9±105.9

圖4 C57BL/6 小鼠感染MNV 不同時間盲腸和結(jié)腸核酸含量變化Note.A, Cecum.B, Colon.Compared with other time points, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Nucleic acid contents in cecum and colon at different days post MNV infection of C57BL/6 mice

表3 各組織病理檢查與核酸檢測結(jié)果比較Table 3 Comparison of pathological examination and nucleic acid test results

3 討論

本文針對MNV 感染國內(nèi)常用的五個品系(包括封閉群和近交系)實驗小鼠引起的組織病理改變情況進行了初步的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有感染組小鼠中肝病變率最高,達8%,主要表現(xiàn)為血管周圍淋巴細胞浸潤；其次為脾,病變率為5.6%,主要表現(xiàn)為脾小結(jié)數(shù)量的減少,脾小結(jié)位于脾白髓中央動脈周圍淋巴鞘的旁側(cè),為B 細胞區(qū),脾小結(jié)數(shù)量減少意味著淋巴細胞數(shù)量的減少,動物免疫力的降低,由于MNV 對小鼠巨噬細胞、樹突狀細胞和B 細胞具有感染親嗜性[15-16],而這些細胞與動物的免疫功能密切相關(guān),表明MNV 感染會影響動物的免疫系統(tǒng),這在我們前面的研究中得到了證實[17]；肺的病變率為4%,主要表現(xiàn)為支氣管周圍的淋巴細胞浸潤；出乎意料的是,雖然MNV 是腸道病原體,但本研究所有動物均未發(fā)現(xiàn)存在盲腸、結(jié)腸及小腸(主要為十二指腸)的病變,推測MNV 已經(jīng)很好的適應(yīng)了宿主的免疫系統(tǒng),因而不引起或只引起輕微的腸道病變[8,12,18]。 最初的研究發(fā)現(xiàn)免疫缺陷小鼠(STAT1-/-/IFNγR-/-)感染MNV 后容易造成較嚴重的組織損傷,如可造成肝和脾的炎癥反應(yīng),組織細胞壞死及肺和腸組織的炎性損傷,并引起全身性的組織病變[1],而本研究小鼠病理改變大多較輕微,表明固有免疫在防御MNV 感染中發(fā)揮著重要作用。 BALB/c-nu 小鼠發(fā)生的病理改變并未明顯高于其他品系小鼠,說明胸腺依賴的T 細胞免疫在MNV感染過程發(fā)揮的作用較輕微。

本研究通過檢測MNV 核酸來間接反映各組織中病毒的含量,從結(jié)果來看,除了肺,其余各組織核酸陽性率遠遠高于病理改變陽性率,其中盲腸和結(jié)腸核酸陽性率均為100%,其次為小腸,臟器組織核酸陽性率較低,其中肺最低,我們在2 份血樣中檢測到了核酸,表明病毒感染有可能引起動物的病毒血癥。 從核酸含量來看,基本與核酸陽性率成正相關(guān),各組織核酸含量由高到低依次為:盲腸＞結(jié)腸＞小腸＞脾＞肺＞肝；各品系相比,除了BALB/c-nu 小鼠結(jié)腸含量顯著高于其他品系,其余均無統(tǒng)計學(xué)差異；分析核酸含量隨感染MNV 的時間變化情況發(fā)現(xiàn),C57BL/6 小鼠盲腸與結(jié)腸的含量均在感染后第14 天顯著高于其他時間點,達到高峰,其余品系各組織的變化均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。 我們分析了病理檢測與核酸檢測的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)兩者并不一致,即病理改變陰性的樣本核酸檢測不一定為陰性,這一發(fā)現(xiàn)與已有研究相似[19],推測可能的原因:病理改變的發(fā)生是動物機體抗病毒免疫應(yīng)答的結(jié)果,通過免疫應(yīng)答來清除組織中的病毒,同時造成了組織本身的炎性病理損傷,而病毒也會通過免疫逃逸機制來拮抗機體的免疫應(yīng)答,最后動物的抗病毒免疫與病毒的拮抗之間達到平衡,病理損傷可隨著時間修復(fù),而病毒仍存在于組織中,從而造成觀察到的病理改變的發(fā)生率遠遠低于病毒陽性率。