何嘉玲暴 國王天奇張長勇李 楠孫德明

(國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心,北京 100081)

斑馬魚(Danio rerio)又名藍(lán)條魚、花條魚、斑馬擔(dān)尼魚,隸屬輻鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼魚屬,是發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域重要的脊椎動物模型[1-5]。 然而,目前國內(nèi)尚缺乏其系統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)描述。 為數(shù)不多的國內(nèi)研究也較多地關(guān)注斑馬魚成魚的組織形態(tài)學(xué)變化,如成魚的腦、腸道、心臟和肝等[6-8]。 在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,由于斑馬魚早期胚胎透明,易于觀察,其在各領(lǐng)域的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)較成魚廣泛。 然而目前國內(nèi)尚未檢索到關(guān)于斑馬魚幼魚石蠟切片條件優(yōu)化的文獻(xiàn)。 研究者在進(jìn)行幼魚石蠟切片的過程中多采用傳統(tǒng)石蠟切片制備方法,切片質(zhì)量良莠不齊[9-10]。 斑馬魚幼魚體型小,含水量高,有必要摸索出一套適合于斑馬魚幼魚的石蠟切片方法,以獲得優(yōu)質(zhì)的組織切片。

優(yōu)質(zhì)的石蠟組織切片能夠保持細(xì)胞間的正常相互關(guān)系,清晰顯示組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),真實(shí)地展示組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。 在條件摸索中我們發(fā)現(xiàn),不恰當(dāng)?shù)氖炃衅谱鞣椒?可能人為導(dǎo)致正常的生理組織出現(xiàn)“異常”的形態(tài)和結(jié)構(gòu),影響實(shí)驗(yàn)的判斷。 本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚幼魚整魚為實(shí)驗(yàn)材料,從固定、脫水,透明等環(huán)節(jié)出發(fā)摸索實(shí)驗(yàn)條件。 通過HE 染色后采集圖像,展示不同條件下獲得的切片效果,為后續(xù)研究者進(jìn)行斑馬魚幼魚切片制作提供有益的參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚成魚為野生型TU 品系,由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張博教授饋贈,20 ～24 周齡,體重約350 ～390 mg,雌雄各4 尾。 按照Westerfield[11]述及的方法飼養(yǎng)、繁育、收集受精卵。 受精卵清洗和消毒后,放入含有1‰(w/v)亞甲基藍(lán)的培養(yǎng)液中,于28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,期間每天更換新鮮培養(yǎng)液。 上述斑馬魚飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(京)2018-0010]完成。 所有研究方案均通過國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審批(NRIFH11-1912-6),嚴(yán)格遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

Tricaine(sigma)；多聚甲醛(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；波恩氏液(北京百奧萊博科技有限公司)；乙醇(宜興市第二化學(xué)試劑廠)；二甲苯(宜興市第二化學(xué)試劑廠)；叔丁醇(上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)；蘇木素染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；伊紅(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。 切片機(jī)(德國萊卡公司)；正置光學(xué)顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固定、脫水、透明

受精后4 d(4 days post fertilization,4dpf)幼魚固定前,用0.02% 的Tricaine(ethylm-aminobenzoate,1 mol/L Tris-HCl,pH9.0)進(jìn)行安樂死。 隨后分別用4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)和Bouin’s液固定24 h。 固定完成后,4%多聚甲醛固定的樣品放入裝有蒸餾水的離心管中,置搖床上,清洗3 ～4次,每15～30 min 換一次水。 Bouin’s 液固定的樣品放入裝有70%乙醇(配制時(shí)50 mL 中加30 μL 濃氨水)的離心管中,同法清洗固定組織,以去除固定液中色素的干擾。

脫水時(shí)間分別為1 min 和4 min,叔丁醇脫水后直接浸蠟,乙醇脫水后經(jīng)二甲苯透明后浸蠟,透明程序?yàn)?無水乙醇-二甲苯等體積混合液2.5 min,二甲苯Ⅰ1 min,二甲苯Ⅱ1 min。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見表1、表2 和表3。

1.3.2 浸蠟、包埋、切片

按照常規(guī)方法進(jìn)行浸蠟,包埋和切片處理。 透明后于65℃浸蠟,共2 次,分別為20 min 和40 min。為獲得斑馬魚不同切面的切片,包埋時(shí)可使用高精密鑷子在液態(tài)石蠟中擺放幼魚。 待蠟塊徹底冷卻后,蠟塊于-20℃冰箱冷凍1 ～2 h,修塊,制備5 μm切片。

1.3.3 HE 染色

石蠟切片的HE 染色參考常規(guī)方法進(jìn)行。 切片65℃干烤1 h 后立即浸入二甲苯脫蠟,二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各25 min。 隨后梯度水化:無水乙醇Ⅰ,無水乙醇Ⅱ,95%乙醇Ⅰ,95%乙醇Ⅱ,75%乙醇,蒸餾水各10 min。 蘇木精-伊紅(HE)染色按常規(guī)方法進(jìn)行:蘇木素染液染色2 min,蒸餾水洗3 次,鹽酸乙醇2 s,蒸餾水洗3 次,氨水乙醇20 s,蒸餾水洗3 次,伊紅染色1 min,蒸餾水洗3次。 隨后75%乙醇快速脫水,95%乙醇Ⅰ,95%乙醇Ⅱ,100%乙醇Ⅰ,100%乙醇Ⅱ各脫水5 min,二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15 min,最后中性樹膠封片,制成永久切片。 用正置顯微鏡觀察并采集圖片。

表1 斑馬魚4 dpf 幼魚石蠟切片實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Experimental group of 4dpf zebrafish larva for paraffin section

表2 脫水過程Table 2 Process of dehydration

表3 透明過程Table 3 Process of transparency

2 結(jié)果

2.1 固定劑對切片效果的影響

參考斑馬魚成魚組織的固定,采用應(yīng)用較多的單一固定劑4% PFA 和復(fù)合固定劑Bouin’s 液分別固定斑馬魚幼魚。 4%多聚甲醛固定的幼魚,后續(xù)無論何種脫水條件,腦組織(圖1a、1b、1e、1f)都出現(xiàn)了明顯的收縮和脆裂,骨骼肌纖維也出現(xiàn)不同程度的收縮,間隙異常增寬(圖2a、2b、2e、2f)。 而經(jīng)Bouin’s 液固定的幼魚,都較好地保持組織的原形,低倍鏡下沒有觀察到明顯的組織脆裂的現(xiàn)象(圖1C、1D、1G、1H)。 但對于幼魚深部的器官,如腸道等則受固定液影響較小,除4% PFA 固定后乙醇梯度脫水1 min 的幼魚(圖2b)以外,其余PFA 固定幼魚的腸道沒有出現(xiàn)類似腦和肌肉組織脆裂的現(xiàn)象。結(jié)果詳見圖1。

此外,在固定過程中應(yīng)注意,為避免機(jī)體出現(xiàn)自溶引起組織結(jié)構(gòu)的改變,魚施行安樂死后,應(yīng)盡快進(jìn)行固定；固定過程中,由于前期硬度不夠,應(yīng)確保幼魚水平擺放,避免體軸彎曲而影響后續(xù)切片和觀察。

2.2 脫水對切片效果的影響

選用常規(guī)的脫水劑乙醇和脫水能力較弱的叔丁醇分別進(jìn)行脫水。 為防止高濃度脫水劑脫水時(shí)間過長導(dǎo)致組織脆化,摸索脫水時(shí)間,分別進(jìn)行1 min 和4 min 梯度脫水。 乙醇屬于非石蠟溶劑,脫水后選擇二甲苯進(jìn)行透明,叔丁醇為兼石蠟溶劑,無需進(jìn)行透明,脫水后可直接浸蠟。

對于腦組織,經(jīng)PFA 固定的幼魚,無論用叔丁醇或乙醇作為脫水劑,脆裂都比較嚴(yán)重,叔丁醇脫水(圖1a、1e)的脆裂程度較乙醇脫水(圖1b、1f)稍輕。 對于眼睛,經(jīng)PFA 固定的幼魚,都出現(xiàn)了明顯的裂痕,其中叔丁醇1 min 梯度脫水的效果最差,裂紋非常嚴(yán)重(圖1a)。 在Bouin’s 液固定的魚中,對于腦組織和眼睛,無論是叔丁醇或是乙醇梯度脫水,都獲得了較好的切片效果,切片無褶無裂痕。但乙醇脫水時(shí)間為4 min 的樣品,可觀察到輕微的刀痕(圖1H、1h),可能與脫水時(shí)間較長,組織硬度較大有關(guān)系。 因此,對于腦組織而言,Bouin’s 液固定后,脫水時(shí)間不宜過長,叔丁醇或乙醇1 min 梯度脫水即可獲得較好的切片效果。

圖1 4 d 斑馬魚幼魚不同實(shí)驗(yàn)分組的大體和局部切片效果Note.The pictures marked with lower case letters are partial enlarged views of the pictures marked with corresponding upper case letters.A/a, 4% PFA fixation, tert-butanol dehydration for 1 min.E/e, 4% PFA fixation, t-butanol dehydration for 4 min.B/b, 4% PFA fixation, ethanol dehydration for 1 min.F/f, 4% PFA Fixation, ethanol dehydration for 4 min.C/c, Bouin’s solution fixation, tert-butanol dehydration for 1 min；G/g,Bouin’s solution fixation, tert-butanol dehydration for 4 min.D/d, Bouin’s solution fixation, ethanol dehydration for 1 min.H/h, Bouin’s solution fixed, ethanol dehydrated for 4 min.Figure 1 General and local sectioning effects of different experimental groupings of 4dpf zebrafish larva

對于肌肉組織,經(jīng)PFA 固定的幼魚,無論利用叔丁醇或乙醇作為脫水劑的切片效果差異不大,都出現(xiàn)不同程度的收縮,間隙增寬。 對于Bouin’s 固定的樣品,使用乙醇進(jìn)行脫水的樣品出現(xiàn)輕微的肌纖維收縮(圖2d、2h),叔丁醇(圖2c、2g)的切片效果優(yōu)于乙醇。 觀察脫水時(shí)間對肌肉組織切片效果的影響發(fā)現(xiàn),脫水時(shí)間4 min 樣品(圖2e、2f、2g、2h)的收縮程度明顯小于1 min 梯度脫水的樣品(圖2a、2b、2c、2d)。 因此,對于肌肉組織,Bouin’s 液固定后,使用叔丁醇脫水優(yōu)于乙醇,且脫水時(shí)間不宜過短,4 min 的叔丁醇梯度脫水能達(dá)到較好的切片效果。 結(jié)果詳見圖2。

圖2 4 d 斑馬魚幼魚不同實(shí)驗(yàn)分組的大體和局部切片效果Note.The pictures marked with lower case letters are partial enlarged views of the pictures marked with corresponding upper case letters.A/a, 4% PFA fixation, tert-butanol dehydration for 1 min.E/e, 4% PFA fixation, t-butanol dehydration for 4 min.B/b, 4% PFA fixation, ethanol dehydration for 1 min.F/f, 4% PFA Fixation, ethanol dehydration for 4 min.C/c, Bouin’s solution fixation, tert-butanol dehydration for 1 min.G/g,Bouin’s solution fixation, tert-butanol dehydration for 4 min.D/d, Bouin’s solution fixation, ethanol dehydration for 1 min.H/h, Bouin’s solution fixed, ethanol dehydrated for 4 min.Figure 2 General and local sectioning effects of different experimental groupings of 4 dpf zebrafish larva

2.3 不同組織最佳的切片條件

對于斑馬魚幼魚的不同組織,由于存在蛋白質(zhì),脂肪及水等含量的差異,對切片的條件有不同的要求[12]。 在本文摸索的條件中,對于斑馬魚幼魚的腦組織,最佳的固定液為Bouin’s 液,后續(xù)使用乙醇或叔丁醇脫水1 min 可以達(dá)到良好的切片效果；對于骨骼肌,最佳的固定液仍是Bouin’s 液,但是對于肌肉組織,叔丁醇脫水的效果明顯優(yōu)于乙醇,并且脫水4 min 的效果優(yōu)于脫水1 min 的效果；消化道組織,受不同固定液和脫水液的影響較小,除4%PFA 固定后,乙醇1 min 梯度脫水出現(xiàn)了較明顯的脆裂外,其余固定和脫水條件下,切片效果都較好,沒有顯著差異；對于幼魚眼睛,4% PFA 固定后裂紋明顯,而經(jīng)Bouin’s 液固定后,除了乙醇梯度脫水4 min 出現(xiàn)輕微刀痕外,都能獲得良好的切片效果。結(jié)果詳見表4。

3 討論

斑馬魚由于其獨(dú)特的優(yōu)勢在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。 相較于成魚,斑馬魚胚胎和幼體具有身體透明,便于顯微鏡觀察,數(shù)量多,有利于高通量實(shí)驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn),在藥物發(fā)育毒理學(xué),環(huán)境毒理學(xué),腫瘤異體移植,遺傳學(xué),疾病動物模型等方面應(yīng)用更為廣泛[13-14]。 研究者往往通過操作斑馬魚幼魚或胚胎,觀察表型變化,獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)論。 而組織器官細(xì)胞水平的變化是表型變化的根本。 組織切片技術(shù)克服了無法觀察組織內(nèi)部變化的不足,是反映組織實(shí)時(shí)狀況最有效的手段,甚至是某些診斷和評價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)。

隨著斑馬魚應(yīng)用的日益廣泛,筆者通過搜索引擎發(fā)現(xiàn),研究人員對斑馬魚幼魚石蠟切片方法有較大的需求。 但經(jīng)文獻(xiàn)搜索,發(fā)現(xiàn)國內(nèi)關(guān)于幼魚石蠟切片的文獻(xiàn)非常匱乏。 僅有幾篇關(guān)于斑馬魚成魚石蠟切片的文獻(xiàn)[7,14-15]。 斑馬魚幼魚具有與成魚不同的組織特性,加之體型小,較難分離組織器官等特點(diǎn),亟需一套適用于斑馬魚幼魚整體石蠟切片的方法。

合適的染色前處理是獲得優(yōu)質(zhì)組織病理切片的基礎(chǔ)。 筆者通過多輪實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)條件摸索,獲得了良好的幼魚整體石蠟切片結(jié)果。 以下將重點(diǎn)討論實(shí)驗(yàn)中需要注意的問題及解決辦法。

染色前的固定、脫水、透明、浸蠟是影響切片質(zhì)量至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。 處理不當(dāng),石蠟切片往往容易出現(xiàn)收縮,裂紋等問題,既不符合石蠟切片的要求,也影響結(jié)果的判斷。

固定是石蠟切片制片的關(guān)鍵,良好的固定劑能迅速穿透組織,保持組織原形,不發(fā)生膨脹或收縮。多聚甲醛是甲醛的聚合物,性質(zhì)比甲醛穩(wěn)定,在傳統(tǒng)的石蠟切片組織樣本固定中廣泛應(yīng)用。 但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,斑馬魚幼魚經(jīng)4% PFA 過夜固定后,導(dǎo)致了幼魚組織不可回復(fù)的硬化,無論后續(xù)脫水條件如何優(yōu)化,腦組織和肌肉組織都出現(xiàn)了明顯的裂痕,嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)觀察。 可能與斑馬魚幼魚組織器官的特性有關(guān)。 Bouin’s 固定液是一種混合固定劑,對幼魚組織硬化作用適中,后續(xù)經(jīng)過適當(dāng)?shù)拿撍?透明和浸蠟等處理,能獲得較滿意的切片,與斑馬魚成魚結(jié)果類似[15]。

脫水就是除去組織內(nèi)部水分以便后續(xù)石蠟的浸入,梯度乙醇是應(yīng)用最廣泛的脫水劑,但對于斑馬魚幼魚的肌肉組織而言,即使是30%起始的梯度乙醇脫水都能引起肌肉纖維的收縮,說明對于幼魚而言,乙醇作為脫水劑脫水能力過強(qiáng)。 改用叔丁醇后,肌肉收縮現(xiàn)象顯著改善。 另外叔丁醇作為脫水劑兼透明劑,可以獲得良好的脫水效果,同時(shí)避免二甲苯透明的環(huán)節(jié),減少了導(dǎo)致組織硬化和脆裂的可能。 對于肌肉組織,Bouin’s 液固定后,無論使用乙醇或叔丁醇作為脫水劑,4 min 的脫水效果都優(yōu)于1 min,可能是與短時(shí)間內(nèi)脫水不盡,殘留在組織細(xì)胞中的水分無法與二甲苯相溶,導(dǎo)致石蠟無法完全滲入有關(guān)。

表4 不同組織在不同條件下的切片效果Table 4 Effects among different tissues under different conditions

通過條件摸索和優(yōu)化,本方法制備的石蠟切片能達(dá)到石蠟切片的質(zhì)量要求,可供以斑馬魚幼魚為研究對象的研究者參考。