范 敏鄭文蘭文曉敏

(1.貴州中醫(yī)藥大學,貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,貴陽 550001)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號轉(zhuǎn)導通路是目前研究細胞凋亡的熱點之一,Caspase-12 作為特有的僅在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下激活的蛋白,與細胞凋亡及疾病發(fā)展變化的關(guān)系已被逐步揭示。 Caspase-7、Caspase-9 與凋亡靶因子Caspase-3 是Caspase-12 通路中的關(guān)鍵蛋白,研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡時Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 呈高表達[1-2]。 本院基于“瘀”是導致異位妊娠主要病因病機的中醫(yī)理論,運用加味宮外孕II 號方保守治療異位妊娠,取得肯定臨床療效,且前期研究證實該方具有誘導細胞凋亡的作用[3],但是否可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應激Caspase-12 信 號 通 路 調(diào) 控Caspase-7、 Caspase-9、Caspase-3 基因表達發(fā)揮促細胞凋亡作用尚未可知。本實驗運用人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVneo代替異位妊娠滋養(yǎng)細胞來研究該方誘導凋亡的機制[4],為中醫(yī)藥保守治療異位妊娠及藥物開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康雌性SD 大鼠36 只,SPF 級,體重(200±20)g,由湖北省實驗動物研究中心提供[SCXK(鄂)2015-0018]。 飼養(yǎng)于湖北省預防醫(yī)學科學院屏障動物實驗環(huán)境[SYXK(鄂)2017-0065]。 本實驗通過湖北省實驗動物管理與使用委員會批準(20182901),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 實驗細胞

HTR-8/SVneo 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系來自于武漢華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院。

1.2 主要試劑與儀器

加味宮外孕II 號方(丹參、赤芍各15 g,桃仁、三棱、莪術(shù)各9 g,蜈蚣4 g,全蝎6 g,土鱉蟲10 g,紫草25 g,購于貴州省中醫(yī)院,熬成3 g/mL 的中藥液備用)；注射用甲氨蝶呤(廣東嶺南制藥有限公司生產(chǎn),國藥準字H20054692)；胎牛血清(美國Gibco)；Caspase-9(中國武漢博士德)；Caspase-7 (美國CST)；Caspase-3(美國Abcam)；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒(中國南京Vazyme)；引物(中國武漢擎科生物)。 QuantStudio 6 型實時熒光定量PCR 儀(美國ABI)；FEI TecnaiG200 TWIN 透射電鏡(美國FEI)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理

36 只大鼠隨機分為6 組,即陰性對照組(B組)、低、中、高劑量的中藥加味宮外孕II 號方組(C組、D 組、E 組)、甲氨蝶呤組(F 組)及中劑量加味宮外孕II 號方+甲氨蝶呤組(G 組)。 由人與大鼠等效劑量換算[5],計算出加味宮外孕II 號方低劑量為12 g/(kg·d),中、高劑量分別為24、48 g/(kg·d)。 B組予中藥中劑量等體積生理鹽水灌胃；C 組、D 組、E組分別予中藥低、中、高劑量灌胃；F 組予中藥中劑量等體積生理鹽水灌胃,G 組予中劑量中藥灌胃,兩組均在取血前1 h 按7.775 mg/kg 體重肌注甲氨蝶呤；灌胃每天1 次,連續(xù)8 d。

1.3.2 含藥血清的制備

第8 天末次給藥1 h 后心臟采血,3000 r/min離心12 min,分離血清,0.22 μm 濾膜過濾除菌,56℃滅活30 min,將同組大鼠的血清混合、分裝,存于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HTR-8/SVneo 細胞培養(yǎng)及處理

用含10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基接種細胞于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中,細胞貼壁生長至85%左右,胰酶消化傳代。 取生長狀態(tài)良好的細胞接種于六孔板,培養(yǎng)24 h,加入對應組別含藥血清,前期研究證實含藥血清體積分數(shù)10%為最佳,故選用此體積分數(shù)含藥血清作用于HTR-8/SVneo 細胞24 h,收集細胞進行相關(guān)指標檢測。 為排除大鼠含藥血清對實驗結(jié)果的干擾,設置未用含藥血清處理的細胞作為空白對照組,作為陰性對照組的參照。

1.3.4 Western blot 檢 測Caspase-7、 Caspase-9、Caspase-3 蛋白表達水平

提取總蛋白并測定濃度,聚丙烯酰胺凝膠上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,一抗(Caspase-7 1 ∶1000、Caspase-9 1 ∶500、Caspase-3 1 ∶2000 稀釋)4℃孵育過夜,TBST 洗膜,二抗(1 ∶5000 稀釋)37℃孵育2 h,TBST 洗膜,ECL 發(fā)光液顯影,膠片定影,BandScan 軟件進行膠片灰度值分析。

1.3.5 Real-time PCR 檢測Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 mRNA 表達水平

提取總RNA 并檢測純度和濃度,RNA 定量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應條件為25℃5 min,50℃15 min,85℃5 min,4℃10 min,配制20 μL 體系進行基因擴增,擴增條件為50℃2 min,95℃10 min,95℃30 s,60℃30 s,40 個循環(huán)。 以2-△△ct進行所得數(shù)據(jù)分析。 引物設計序列如下(見表1)。

1.3.6 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化

分別用2.5%戊二醛及1%四氧鋨酸室溫固定,按常規(guī)方法乙醇梯度脫水,再使用丙酮和Epon-812包埋劑等體積混合液與純Epon-812 包埋劑滲透,制成70 nm 超薄切片,2%醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示,計量資料組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HTR-8/SVneo 細 胞Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 蛋白相對表達量

A 組與B 組比較無差異(P＞0.05)。 與B 組比較,C 組Caspase-7 蛋白無差異(P＞0.05),D、E、F、G組表達量上調(diào)(P＜0.05)；與C 組比較,E、F、G 組蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)；與D 組比較,E、G 組蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)；與F 組比較,E 組蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)；G 組與E、F 組比較無差異(P＞0.05)。 與B 組比較,C、D、E、F、G 組Caspase-9 蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)；與C 組比較,D、E、F、G 組蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)；與D、F、G 組比較,E 組表達量上調(diào)(P＜0.05)；F 組與G 組比較無差異(P＞0.05)。 與B 組比較,C、D、E、F、G 組Caspase-3 蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)；與C、D 組比較,E、F、G 組蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)；與F、G 組比較,E 組蛋白表達量上調(diào)(P＜0.05)；F 組與G 組比較無差異(P＞0.05),(見圖1、表2)。

2.2 HTR-8/SVneo 細 胞Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 mRNA 相對表達量

A 組與B 組比較無差異(P＞0.05)。 與B 組比較,C、D、E、F、G 組Caspase-7 mRNA 表達量上調(diào)(P＜0.05)；與C、D 組比較,E、G 組mRNA 表達量上調(diào)(P＜0.05)；與F 組比較,E 組mRNA 表達量上調(diào)(P＜0.05),G 組無差異(P＞0.05)；E 組與G 組比較無差異(P＞0.05)。 與B 組比較,C 組Caspase-9 mRNA 表達無差異(P＞0.05),D、E、F、G 組表達量上調(diào)(P＜0.05)；與C 組比較,E、F、G 組mRNA 表達量上調(diào)(P＜0.05)；與D、F、G 組比較,E 組mRNA 表達量上調(diào)(P＜0.05)；F 組與G 組比較無差異(P＞0.05)。 與B 組比較,C、D、E、F、G 組Caspase-3 mRNA 表達量上調(diào)(P＜0.05)；與C 組比較,E、G 組mRNA 表達量上調(diào)(P＜0.05)；與D 組比較,E、F、G組mRNA 表達量上調(diào)(P＜0.05)；E、F、G 組三者比較無差異(P＞0.05),(見表3)。

2.3 透射電鏡觀察HTR-8/SVneo 細胞超微結(jié)構(gòu)的變化

A、B 組細胞包膜完整,表面有微絨毛,見清晰的核膜及核仁,均勻的染色質(zhì)散布于核膜內(nèi),細胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體清晰可見,線粒體內(nèi)外膜完整、形態(tài)良好；C、D、E、F、G 組微絨毛減少,其中C、D 組異染色質(zhì)沿核膜邊集,部分線粒體腫脹、脊紊亂或斷裂,E、F、G 組細胞核不規(guī)則,染色質(zhì)固縮,邊集于核內(nèi)的異染色質(zhì)增多,胞漿內(nèi)布滿腫脹的線粒體,部分出現(xiàn)脊紊亂或斷裂、甚至消失,線粒體空泡化；E、G 組觀察到自噬體形成增多,(見圖2)。

圖1 HTR-8/SVneo 細胞蛋白表達量Figure 1 Protein expression of HTR-8/SVneo cells

表2 HTR-8/SVneo 細胞Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 蛋白表達量,n=3)Table 2 Protein expression of Caspase-7,Caspase-9 and Caspase-3 in HTR-8/SVneo cells

表2 HTR-8/SVneo 細胞Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 蛋白表達量,n=3)Table 2 Protein expression of Caspase-7,Caspase-9 and Caspase-3 in HTR-8/SVneo cells

注:與A、B 組比較,*P＜0.05；與C 組比較,▲P＜0.05；與D 組比較,●P＜0.05；與E 組比較,□P＜0.05。Note.Compared with group A and B, *P＜0.05.Compared with group C, ▲P＜0.05.Compared with group D, ●P＜0.05.Compared with group E,□P＜0.05.

組別Groups Caspase-7 Caspase-9 Caspase-3 A 組 Group A 0.037±0.005 0.070±0.005 0.053±0.008 B 組 Group B 0.036±0.006 0.073±0.009 0.057±0.011 C 組 Group C 0.081±0.015 0.121±0.018* 0.141±0.006*D 組 Group D 0.129±0.032* 0.187±0.019*▲ 0.104±0.009*E 組 Group E 0.264±0.016*▲● 0.269±0.027*▲● 0.272±0.014*▲●F 組 Group F 0.182±0.024*▲□ 0.212±0.010*▲□ 0.173±0.005*▲●□G 組 Group G 0.231±0.010*▲● 0.216±0.004*▲□ 0.202±0.012*▲●□

表3 HTR-8/SVneo 細胞Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 mRNA 表達量(,n=3)Table 3 Expression of Caspase-7, Caspase-9 and Caspase-3 mRNA in HTR-8/SVneo cells

表3 HTR-8/SVneo 細胞Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 mRNA 表達量(,n=3)Table 3 Expression of Caspase-7, Caspase-9 and Caspase-3 mRNA in HTR-8/SVneo cells

注:與A、B 組比較,*P＜0.05；與C 組比較,▲P＜0.05；與D 組比較,●P＜0.05；與E 組比較,□P＜0.05。Note.Compared with group A and B, *P＜0.05.Compared with group C, ▲P＜0.05.Compared with group D, ●P＜0.05.Compared with group E,□P＜0.05.

組別Groups Caspase-7 Caspase-9 Caspase-3 A 組 Group A 1.030±0.088 1.004±0.054 0.940±0.071 B 組 Group B 1.089±0.057 1.019±0.063 1.025±0.143 C 組 Group C 1.507±0.193* 1.380±0.123 1.895±0.149*D 組 Group D 1.583±0.063* 1.655±0.122* 1.805±0.218*E 組 Group E 2.312±0.159*▲● 2.444±0.176*▲● 3.060±0.340*▲●F 組 Group F 1.701±0.078*□ 1.950±0.185*▲□ 2.483±0.351*●G 組 Group G 1.988±0.179*▲● 1.905±0.219*▲□ 2.964±0.084*▲●

圖2 HTR-8/SVneo 細胞透射電鏡觀察Note.Red arrow indicates mitochondria.Blue arrow indicates autophagy.Figure 2 TEM observation of HTR-8/SVneo cells

3 討論

本實驗從蛋白、基因水平測定及形態(tài)學觀察,研究妊娠滋養(yǎng)葉細胞凋亡情況。 為排除大鼠含藥血清對實驗結(jié)果的干擾,設置空白對照組作為參照,確保實驗結(jié)果的準確性。 細胞凋亡是指在多種條件刺激下,多基因、多通路聯(lián)合調(diào)控的細胞主動有序的死亡方式[6]。 細胞凋亡的發(fā)生可清除體內(nèi)有害、多余、突變或衰老的細胞,同時抑制細胞過度增殖[7],在胚胎發(fā)育、腫瘤的發(fā)生及自身免疫系統(tǒng)疾病中占有重要地位[8]。 現(xiàn)研究的細胞凋亡途徑主要有死亡受體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[9]。 研究顯示中藥可以通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對疾病產(chǎn)生影響[10]。 活血化瘀中藥可通過死亡受體通路和線粒體通路促使異位妊娠胚胎死亡已有報道,而關(guān)于本院經(jīng)驗方加味宮外孕II 號方能否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導滋養(yǎng)細胞凋亡尚未闡明。 研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與子癇前期、妊娠期糖尿病等妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[11-12]。 各種因素如Ca2+紊亂、氧化應激、病毒感染、營養(yǎng)缺乏、缺氧、藥物或環(huán)境應激引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙[13-14],蛋白質(zhì)在腔內(nèi)正確折疊受阻,出現(xiàn)過量的錯誤折疊和未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累的現(xiàn)象稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[15-16]。 適當?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可促進蛋白質(zhì)的重新折疊或抑制蛋白質(zhì)的合成以減輕細胞損傷,同時清除不可逆損傷細胞恢復穩(wěn)態(tài),而過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激超過未折疊蛋白的承受能力無法修復細胞損傷時,則引起Caspase 和相關(guān)蛋白酶的激活,引發(fā)凋亡級聯(lián)放大效應[17]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應激時,胞質(zhì)中的Caspase-7 轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面發(fā)生蛋白水解,Caspase-7 激活Caspase-12,活化的Caspase-12 裂解Caspase-9,進而分解凋亡效應因子Caspase-3 誘發(fā)細胞凋亡[18]。 課題前期研究結(jié)果提示加味宮外孕II 號方含藥血清處理的HTR-8/SVneo 細胞中僅在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時活化的Caspase-12 蛋白及基因水平呈高表達。 從以上數(shù)據(jù)分析,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)中、高劑量中藥、甲氨蝶呤及二者聯(lián)合用藥干預后的大鼠血清作用于HTR-8/SVneo細胞,Caspase-7、Caspase-9 蛋白及mRNA 表達水平與所有藥物處理組的Caspase-3 蛋白及mRNA 表達量均較空白及陰性對照組增加,中藥低劑量組Caspase-7 mRNA、Caspase-9 蛋白表達增加,提示中藥及甲氨蝶呤能夠上調(diào)Caspase-12 通路中凋亡因子的表達。 中藥低劑量組Caspase-7 蛋白、Caspase-9 mRNA 表達與空白及陰性對照組比較無差異,考慮可能與此劑量下蛋白剪切激活、轉(zhuǎn)錄后修飾有關(guān)。經(jīng)中藥中、高劑量與甲氨蝶呤處理的滋養(yǎng)葉細胞蛋白與基因表達處于高水平,說明HTR-8/SVneo 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生過度應激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路被激活,通過調(diào)控Caspase-12 信號通路發(fā)揮凋亡作用。 由此推測,加味宮外孕II 號方及甲氨蝶呤促妊娠滋養(yǎng)葉細胞凋亡的機制之一可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應激激活 Caspase-12 通 路 誘 導 Caspase-7、 Caspase-9、Caspase-3 因子活化的凋亡途徑。 其中中藥高劑量組較中藥低、中劑量組表達更顯著,說明高劑量較低、中劑量促細胞凋亡作用增強,可達到進一步促進胚胎消亡的功效。 而中藥高劑量組殺胚效果與甲氨蝶呤組、中西藥結(jié)合組相近,鄭文蘭等[19]研究顯示中藥加大劑量時殺胚效果增強,且對肝的損傷較使用甲氨蝶呤小,鑒于中藥具有高效殺胚且低毒副作用的特點,臨床值得推廣應用。

本實驗還通過細胞形態(tài)學、超微結(jié)構(gòu)的變化進一步觀察細胞凋亡情況。 發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量中藥、甲氨蝶呤與中西藥結(jié)合含藥血清處理HTR-8/SVneo細胞,出現(xiàn)染色質(zhì)固縮,異染色質(zhì)邊緣化,部分線粒體腫脹、脊紊亂或斷裂、甚至消失,線粒體空泡化等凋亡特征。 電鏡下未見明顯凋亡小體,可能與細胞尚處于凋亡早期,未進入核碎裂階段有關(guān)。 線粒體在細胞凋亡發(fā)生時反應較靈敏,中藥高劑量組、甲氨蝶呤組與中西藥結(jié)合組線粒體損傷嚴重,且中藥高劑量組與中西藥結(jié)合組可見自噬體形成增多,研究提示細胞自噬過度可啟動凋亡,使細胞程序化死亡,二者存在協(xié)同關(guān)系[20]。 本研究從形態(tài)學上證實經(jīng)不同劑量的中藥、西藥及中西藥結(jié)合含藥血清處理的細胞存在不同程度損傷和細胞凋亡的典型特征。 因此我們推斷加味宮外孕II 號方通過損壞妊娠滋養(yǎng)葉細胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu),使線粒體功能障礙,ATP 合成受阻,致妊娠組織失去營養(yǎng)支持而消亡。

綜上,加味宮外孕II 號方可破壞滋養(yǎng)葉細胞的超微結(jié)構(gòu),誘導細胞凋亡,其機制可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應激激活Caspase-12 通路,通過上調(diào)Caspase-7、Caspase-9、Caspase-3 凋亡基因的表達促使滋養(yǎng)葉細胞凋亡。 本研究在細胞超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)大量自噬體形成,可能該方與自噬也存在一定關(guān)系,下一步可針對滋養(yǎng)葉細胞自噬機制開展研究,挖掘中醫(yī)藥保守治療異位妊娠的更多理論依據(jù)。