李文奇馮 磊

(1.江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

心臟重塑是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要階段,是多種心血管疾病的病理基礎(chǔ),其發(fā)病機制包括交感-兒茶酚胺系統(tǒng)的過度激活、細胞鈣信號的改變等,其中β-腎上腺素受體(β-AR)及其信號通路的過度激活是心臟重塑過程中最最重要的機制。 β-腎上腺素受體(β-AR)是G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的成員之一,能夠?qū)⒓毎庑盘杺鬟f到細胞內(nèi),引起生物學(xué)功能的相應(yīng)改變[1]。 心臟交感神經(jīng)激活后釋放兒茶酚胺,而兒茶酚胺作用于β-AR,發(fā)揮其生理和病理效應(yīng)[2-3]。 交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活,兒茶酚胺水平的升高,在心臟重塑的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。 兒茶酚胺的過度釋放會激活腎上腺素受體,最終導(dǎo)致心力衰竭[4-7]。 然而慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的心臟重塑仍然受一些因素影響,如性別因素。 既往的研究指出,性別可能影響慢性容量超負荷或心肌梗死引起的心臟重塑。 在慢性容量超負荷引起的心臟重塑模型中,雌性大鼠左心室擴張程度小于雄性大鼠[8]。 此外,雌性大鼠心肌梗死后左心室肥厚程度相比雄性大鼠有所減輕[9]。 然而,性別差異是否影響腎上腺素受體介導(dǎo)的心臟重塑尚不清楚。 因此,本研究擬通過比較性別對于慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的心臟重塑,為性別對β-AR 介導(dǎo)心臟重塑的差異提供了證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

12 周齡、體重22 ～24 g 的SPF 級野生型C57BL/6 小鼠28 只,雌雄各半,分別隨機分為2 組,每組7 只。 小鼠來源于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心[SCXK(京)2016-0010],動物飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心SPF 級動物飼養(yǎng)屏障環(huán)境[SYXK(京)2016-0041]中,溫度維持在22℃ ～25℃,濕度保持在50%～55%、12 h 明暗交替采光,小鼠自由進食飲水,所有動物實驗遵守北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理要求(LA2010-048),并按照實驗動物的3R 原則基于人道的關(guān)懷。

1.2 主要儀器

ISO(WXBC5302 V)購自Sigma 公司；Vevo 2100小動物超聲儀(2100CR0674)購自FujiFilm Visual Sonics 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠心臟重塑模型的構(gòu)建

將小鼠隨機分為4 組:雄性對照組、雄性ISO組、雌性對照組、雌性ISO 組。 ISO 組小鼠皮下注射異丙基腎上腺素ISO 10 mg/(kg·d)(WXBC5302V,Sigma)14 d,誘導(dǎo)小鼠心臟重塑模型,對照組小鼠皮下注射等量生理鹽水14 d。

1.3.2 超聲心動圖

使用Vevo 2100 小動物超聲儀(2100CR0674,FujiFilm Visual Sonics),探頭頻率為30 MHz,將探頭置于小鼠胸骨前,用1.5%異氟醚麻醉小鼠,以獲得準(zhǔn)確和穩(wěn)定的圖像,二維超聲心動圖在乳頭肌水平的短軸上捕捉到最大的左室直徑。 采用M 型圖像測量舒張期左室后壁厚度(LVPW；d),分別計算左心室射血分?jǐn)?shù)(EF,%) 和左心室短軸縮短率(FS,%),以評估心臟收縮功能。 連續(xù)測量三個心動周期,計算均值。

1.3.3 心臟取材

稱取小鼠體重(body weight,BW),麻醉后打開胸腔,用預(yù)冷的PBS 沖洗殘余血液,用濾紙蘸干心臟周圍水分,稱重并記錄心臟體重(heart weight,HW)。 將小鼠右側(cè)脛骨取出,用游標(biāo)卡尺測量脛骨長度(tibia length,TL),分別計算心體比(HW/BW)和心脛比(HW/TL)。 將心臟沿短軸中點處切開,取心底部心臟置于4%的中性甲醛進行固定。 剩余心臟組織小心放入凍存管并迅速放于液氮中,-80℃冰箱中儲存。

1.3.4 HE 染色

小鼠麻醉后處死取材,將心臟固定在甲醛中,包埋于石蠟,并切成厚度為5 μm 的石蠟切片。 標(biāo)本用乙醇梯度脫水,石蠟包埋。 用HE 染色評價心肌細胞面積,顯微鏡下獲得心肌細胞形態(tài)圖像,使用Image-Pro-Plus 6 軟件進行測量。

1.3.5 天狼猩紅染色

苦味酸-天狼猩紅染色觀察膠原沉積情況,用纖維化面積百分比評價心臟纖維化。 膠原蛋白和整個心臟的面積由Image-Pro-Plus 6 軟件測量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)進行統(tǒng)計分析,計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,所有數(shù)據(jù)均采用雙因素方差分析,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 性別對心體比和心脛比的影響

通過比較小鼠心體比與心脛比,評價心臟肥大。 發(fā)現(xiàn)與對照組相比,ISO 組小鼠的心臟均出現(xiàn)明顯的肥大(見圖1a),與對照組相比,雄性ISO 組心體比和心脛比分別增加9.1% (P＜0.05) 和43.7%(P＜0.001),雌性ISO 組心體比和心脛比分別增加12.9%和13.4%(均為P＜0.05),而與雌性ISO 組相比,雄性ISO 組心脛比增加了19.8%(P＜0.01)(見圖1b、1c)。

2.2 性別對心臟肥大的影響

通過HE 染色的方法,評價心臟形態(tài)變化。 雄性ISO 組與對照組相比,小鼠心肌細胞橫截面積增加了19.7%(P＜0.0001),雌性ISO 組與對照組相比,小鼠心肌細胞橫截面積增加了17.0%(P＜0.0001),而與雌性ISO 組相比,雄性ISO 組心肌細胞橫截面積增加了11.6%(P＜0.01)(見圖2b、2c)。超聲心動圖檢測心臟舒張末期室壁厚度LVPW；d,雄性ISO 組與對照組相比,LVPW；d 增加了31.4%(P＜0.001),雄性ISO 組LVPW；d 增加了21.5%(P＜0.05),而雌雄組ISO 組之間無明顯差異(見圖2)。 提示性別對慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的有一定影響,相較于雄鼠,雌鼠對于慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的心臟肥大反應(yīng)性較差。

2.3 性別對心臟纖維化的影響

圖1 性別對心體比和心脛比的影響(n=7)Note.a, General view of mice heart.b,Quantitative analysis of the ratio of heart weight to length body weight (HW/BW ratio) (n=7).c,Quantitative analysis of the ratio of heart weight to length tibia (HW/TL ratio) (n=7).HW/BW ratio, Compared with relevant control group, *P＜0.05.HW/TL ratio, Compared with male control group, ***P ＜0.001.Compared with female control group, *P ＜0.05.Compared with female ISO group, ###P＜0.001.Figure 1 Effects of gender on the HW/BW ratio and HW/TL ratio

圖2 性別對心臟肥大的影響(n=7)Note.a, Representative HE staining micrographs displaying heart.b, Representative HE staining micrographs displaying cardiomyocyte crosssectional area.c, Quantitative analysis of cardiomyocyte cross-sectional area (n=7).d, Quantitative analysis of diastolic left ventricular posterior wall thickness (LVPW,d) after ISO-treatment for 14 days.Cardiomyocyte cross-sectional area, Compared with male control group, ****P＜0.0001.Compared with female control group, *P＜0.05.Compared with female ISO group, ##P＜0.01.LVPW；d, Compared with male control group,***P＜0.001.Compared with female control group,*P＜0.05.Figure 2 Effects of gender on the cardiac hypertrophy

圖3 性別對心臟纖維化的影響(n=7)Note.a, Representative micrographs of picrosirius red staining.b, Quantitative analysis of cardiac collagen content.Compared with male control group, ****P＜0.0001.Compared with female control group, *P＜0.05.Compared with female ISO group, ####P＜0.0001.Figure 3 Effects of gender on cardiac fibrosis

通過天狼猩紅染色的方法,評價心臟膠原沉積情況。 發(fā)現(xiàn)與對照組相比,ISO 組膠原沉積明顯增加雄性ISO 組小鼠心臟纖維化面積增加了158%(P＜0.0001),雌性ISO 組小鼠增加了39.7%(P＜0.05),而實驗組中,與雄性ISO 組相比,雌性ISO 組心臟的纖維化面積降低了54.4%(P＜0.0001)(見圖3)。 提示性別對慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的心臟纖維化有一定影響,相較于雄鼠,雌鼠對于慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的心臟纖維化反應(yīng)性較差。

2.4 性別對心功能的影響

通過超聲心動圖的方法(見圖4a),測定小鼠EF 值和FS 值,評價心臟的收縮功能。 發(fā)現(xiàn)與對照組相比,EF 值和FS 值均無明顯差異,ISO 組雌雄鼠之間也無明顯差異(見圖4b、4c),提示性別對慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的心臟收縮功能無明顯影響。

3 討論

心臟重塑是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要階段,是多種心血管疾病的病理基礎(chǔ),主要有心臟肥大和心臟纖維化兩種病理表現(xiàn)。 β-腎上腺素受體(β-AR)是G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的成員之一,能夠?qū)⒓毎庑盘杺鬟f到細胞內(nèi),激活受體下游一系列信號途徑,從而引起生物學(xué)功能的相應(yīng)改變[1-3]。 β-AR 及其信號通路的過度激活在心臟重塑的發(fā)生發(fā)展的整個過程中起十分關(guān)鍵的作用,生理條件下,心臟交感神經(jīng)系統(tǒng)激活后釋放兒茶酚胺,而兒茶酚胺作用于β-AR,發(fā)揮其生理和病理效應(yīng)。 交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活,兒茶酚胺水平的升高,在心臟重塑的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。 兒茶酚胺的過度釋放會激活腎上腺素受體,最終導(dǎo)致心力衰竭[4-7]。 受體阻滯劑被廣泛應(yīng)用于慢性心力衰竭的治療中,其作用機制是抑制心臟交感神經(jīng)過度激活,能夠有效抑制心臟重塑,改善心臟收縮功能[10-12]。

既往的研究指出,性別可能影響慢性容量超負荷或心肌梗死引起的心臟重塑。 在慢性容量超負荷引起的心臟重塑模型中,雌性大鼠左心室擴張程度小于雄性大鼠[8]。 此外,雌性大鼠心肌梗死后左心室肥厚程度相比雄性大鼠有所減輕[9]。 然而,性別差異是否影響腎上腺素受體介導(dǎo)的心臟重塑尚不清楚。 因此,本文為性別對于β-AR 介導(dǎo)心臟重塑的差異提供了證據(jù)。

在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的心臟重塑中存在著性別差異,雌鼠對慢性交感應(yīng)激的反應(yīng)性較差。 與雄性ISO 組相比,雌性ISO 組小鼠心臟體積減小,心脛比明顯降低。 而心功能的結(jié)果顯示,雌雄鼠間無明顯差異。 原因可能是心臟重構(gòu)處于代償階段,心功能未受損[13]。

已有的研究表明,性別在其它類型的重塑中也存在著類似的差異。 在小鼠心肌梗死后的心臟重塑中,相比于雄性小鼠,雌性小鼠表現(xiàn)為心肌肥厚程度減少；而在容量負荷引起的心臟重塑中,也觀察到了性別的差異[14]。 此外,動物實驗的結(jié)果也表明,與雄性大鼠相比,雌鼠對容量負荷引起的心臟重塑有較好的保護作用[15-16]。

圖4 性別對心功能的影響(n=7)Note.a, Representative parasternal short axis view echocardiographic M-mode images after ISO-treatment for 14 days.b, Quantitative analysis of ejection fraction (EF) after ISO-treatment for 7 days (n=7).c, Quantitative analysis of fraction shortening (FS) after ISO-treatment for 7 days .Figure 4 Effects of gender on cardiac function

我們發(fā)現(xiàn)在慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致的心臟肥大和心臟纖維化中存在性別差異,其可能的機制主要有三個:1.影響兒茶酚胺濃度和反應(yīng)性。 兒茶酚胺主要包括腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA),兒茶酚胺通過腎上腺素受體激活交感神經(jīng)系統(tǒng)。 而性別可以影響血漿兒茶酚胺濃度。 研究發(fā)現(xiàn),切除性腺的雌性大鼠血漿兒茶酚胺濃度高于對照組[17]。 同時性別在應(yīng)激反應(yīng)的血漿兒茶酚胺調(diào)節(jié)中也起著重要作用。 例如,雌性小鼠在胰島素誘導(dǎo)的低血糖期間兒茶酚胺反應(yīng)較弱[18]。 此外,有研究指出與進行傾斜試驗的年齡相關(guān)男性相比,女性志愿者去甲腎上腺素的增加明顯減少[14]。 因此,血漿兒茶酚胺調(diào)節(jié)的性別差異可能與ISO 誘導(dǎo)的心臟重塑的性別差異有關(guān)。 2.影響雌激素。 雌激素在心臟病中起關(guān)鍵作用[19]。 β-AR 的調(diào)控依賴于雌激素,慢性雌激素治療可降低β-AR 的反應(yīng)性[20]。 慢性雌激素治療可以增加兒茶酚胺的分泌,而兒茶酚胺分泌能夠降低β-AR 的表達和反應(yīng)性[21]。 而研究指出,雌性大鼠卵巢切除后,β1-AR 的表達明顯增加,而給予雌激素補充后其表達趨于正常[22]。 此外,還有研究報道心肌細胞和成纖維細胞中均含有功能性的雌激素受體,提示心臟疾病的性別差異可能與雌激素對心臟的直接影響有關(guān)[23]。 3.影響黃體酮和睪酮。 黃體酮和睪酮與心臟疾病的進程密切相關(guān)。 黃體酮可保護女性免受III 類抗心律失常藥物引起的心律失常,可以通過與雌激素的協(xié)同作用減弱小鼠的結(jié)合親和力[24]。 而與雌激素和黃體酮對心臟病的保護作用相反,睪酮會加重急性心肌炎癥,并對心臟早期重塑產(chǎn)生不利影響[25]。

在本研究中,我們的數(shù)據(jù)提供了性別對于慢性交感應(yīng)激導(dǎo)致心臟重塑的證據(jù),為心臟重塑患者的針對性治療提供了依據(jù)。