廉 梅林曉琳賈俊雙肖勝軍肖 東*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心,廣州 510515；3.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科,廣西 桂林 541199)

TRIM(三結(jié)構(gòu)域蛋白,Tripartite motif)家族蛋白具有高度保守的RBCC 結(jié)構(gòu)域,由眾多的成員組成,廣泛存在于大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi),具有免疫調(diào)節(jié)和E3泛素連接酶活性,可參與機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程和泛素依賴(lài)的蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解[1]。 大多數(shù)TRIM 蛋白由一個(gè)RING 鋅指結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或兩個(gè)B-box 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil,CC),又被稱(chēng)為RBCC 結(jié)構(gòu)域[2]。 到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了70 多個(gè)人源TRIM 蛋白,它們?cè)跈C(jī)體中參與了多種生物過(guò)程和疾病發(fā)病機(jī)制的調(diào)控過(guò)程。

TRIM26/ZNF173/RNF95 基因位于6 號(hào)染色體的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)區(qū)域[3]。 TRIM26 由一個(gè)RING 鋅指結(jié)構(gòu)域、一個(gè)B-box 2 結(jié)構(gòu)、一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PRY-SPRY 結(jié)構(gòu)域[4]組成；其中鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA,參與基因表達(dá)調(diào)控,RING 結(jié)構(gòu)域具有E3 泛素連接酶的活性[5],B-box 2 結(jié)構(gòu)域參與蛋白泛素化修飾調(diào)節(jié),PRY-SPRY 結(jié)構(gòu)域?qū)γ庖邞?yīng)答有調(diào)控作用,可以促進(jìn)多聚信號(hào)復(fù)合體的形成[6]。 迄今,為數(shù)不多的研究表明,TRIM26 具有E3 泛素連接酶的活性[7],其在呼吸道疾病[8]、抗HIV-1 感染[9]和作為精神分裂癥的易感基因[10]等方面發(fā)揮著重要作用。 此外,E3 連接酶TRIM26 通過(guò)泛素化降解核內(nèi)的IRF3 負(fù)向調(diào)控IFN-β 的產(chǎn)生和抗病毒免疫反應(yīng)[11]；TRIM26 是抗RNA 病毒先天免疫反應(yīng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子[12]。

最近有研究表明,TRIM26 與腫瘤有一定關(guān)系。Mule 和TRIM26 介導(dǎo)的NEIL1 泛素化依賴(lài)調(diào)節(jié)是細(xì)胞DNA 損傷反應(yīng)所需要的,RNA 干擾沉默TRIM26 表達(dá)可增強(qiáng)人骨肉瘤U2OS 細(xì)胞對(duì)放療的抵抗性[13]。 TRIM26 可通過(guò)泛素化調(diào)節(jié)NTH1 參與人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激敏感性的調(diào)控,RNA 干擾沉默TRIM26 表達(dá)可增強(qiáng)對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)所致HCT116 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[14]。 此外,RT-qPCR、基因芯片和原位雜交等研究結(jié)果顯示,TRIM26 在鼻咽癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)；同時(shí),基因芯片數(shù)據(jù)亦揭示,在下調(diào)最明顯的10個(gè)基因中,TRIM26 位于第4 位[15]。 新近研究亦證實(shí),鼻咽癌組織中TRIM26 表達(dá)下調(diào)與鼻咽癌低免疫反應(yīng)密切相關(guān)[16]。 總之,目前對(duì)TRIM26 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用仍然知之甚少,還有待進(jìn)一步的探索。

為明確TRIM26 在人和小鼠主要組織器官上的表達(dá)譜,本文通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)TRIM26在正常人體和小鼠組織器官中的表達(dá),了解該基因在不同組織上的表達(dá)定位情況,再結(jié)合BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù)和RT-qPCR 對(duì)TRIM26 在組織上的表達(dá)水平進(jìn)行分析。 通過(guò)表達(dá)定位和表達(dá)水平的綜合分析,明確該基因在人和小鼠主要組織器官上的表達(dá)譜,將為利用TRIM26 條件性敲除小鼠解析TRIM26 在不同組織器官的功能及其在腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用及其分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠,雌性5 只,30 ～35 日齡,體重15～17 g,購(gòu)買(mǎi)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2016-0041],飼養(yǎng)在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部[SYXK(粵) 2016 -0167]。 實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審批(L2017068),符合3R 原則。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)組織

正常人體組織標(biāo)本來(lái)自桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科,取自手術(shù)切除器官病變旁正常組織(標(biāo)本來(lái)源經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并由患者簽署知情同意書(shū))。 肝(10 例),胃(7例),肺(6 例),結(jié)腸、胰腺、腎和脾(各5 例),食管和子宮內(nèi)膜(各4 例),甲狀腺、皮膚和乳腺(各3例),腦和卵巢(各2 例)。 所有組織經(jīng)病理學(xué)檢查不含癌組織。

1.2 主要試劑與儀器

無(wú)水乙醇、二甲苯、氯仿、異丙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；TRIM26 抗體(ab188017) (美國(guó)Abcam 公司)；PBS 緩沖液粉末、檸檬酸鹽修復(fù)液(pH6.0)、封閉用羊血清(工作液)、兔二步法試劑盒(內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、酶標(biāo)山羊抗兔IgG 聚合物)、DAB 顯色試劑盒(20X)、蘇木素染色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TRIzol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公司)。 熒光定量PCR 儀(LightCycler?96,瑞士Roche 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本處理

4%多聚甲醛溶液固定組織24 h,常規(guī)石蠟脫水、包埋、切片(4 μm)(為減少誤差,相同器官組織包埋于一個(gè)蠟塊上)。

1.3.2 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色

選擇PV-9000 二步法(非生物素):石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后,滴加一抗并4℃過(guò)夜；酶標(biāo)山羊抗兔IgG 聚合物37℃孵育30 min,DAB 顯色(顯色時(shí)間控制一致),蘇木素復(fù)染,經(jīng)過(guò)梯度乙醇與二甲苯脫水,最后中性樹(shù)脂封片后在光鏡觀察并拍照。 陰性對(duì)照為PBS 代替一抗。

1.3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀

免疫組織化學(xué)染色,呈棕黃色為陽(yáng)性,不著色為陰性。 結(jié)果由兩位桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科醫(yī)生獨(dú)立判讀TRIM26 所表達(dá)的組織部位并評(píng)分,根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度不同分為0 ～3 分,分別代表TRIM26 在組織上不表達(dá)、弱陽(yáng)性表達(dá)、中等陽(yáng)性表達(dá)和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),統(tǒng)計(jì)評(píng)分結(jié)果,確定該基因在不同組織上的表達(dá)強(qiáng)度。 陰性對(duì)照不著色為不表達(dá)。

1.3.4 BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù)中的Gene Atlas U133 A,gcrma(http://biogps.org/)數(shù)據(jù)集,分析TRIM26 在人的主要組織器官中的mRNA 表達(dá)水平,并用GraphPad Prism 5 做柱形圖。

1.3.5 小鼠組織RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-qPCR)

收取小鼠主要組織器官,按說(shuō)明書(shū)抽提總RNA和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 以獲得的cDNA 為模板,設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)。 選擇GAPDH 基因作為內(nèi)參照,檢測(cè)TRIM26 的表達(dá)；選擇在小鼠組織中表達(dá)量最低的組織為1,其他組織器官按其相對(duì)表達(dá)量作圖。

小 鼠 GAPDH 上 游 引 物 序 列: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物序列:5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′；小鼠TRIM26 上游引物序列:5′-TCGGCCAGTGGATACCTACAT-3′,下游引物序列:5′-TGGCTCACAGTCAAACTGCTG-3′。

2 結(jié)果

2.1 人體主要組織器官中TRIM26 的表達(dá)譜

對(duì)不同人體組織的IHC 染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分,染色呈深棕色為強(qiáng)表達(dá),不著色為不表達(dá)。 IHC 結(jié)果分析顯示,TRIM26 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,少部分組織定位于細(xì)胞核,同一組織的表達(dá)定位在多例標(biāo)本中一致(圖1)。 在食管鱗狀上皮細(xì)胞(圖1A)、胃底腺上皮細(xì)胞(圖1B)、小腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞(圖1C、1D)、肝細(xì)胞(圖1E)、胰島細(xì)胞(圖1F)、腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞(圖1G)、氣管及支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞(圖1H)、肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞(圖1I)、脾血竇內(nèi)皮細(xì)胞(圖1J)、腎小管和腎球囊壁上皮細(xì)胞及腎小球細(xì)胞(圖1K)、卵巢間質(zhì)細(xì)胞(圖1L)、子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(圖1M)、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞(圖1N)、乳腺小葉上皮細(xì)胞(圖1O)和鱗狀上皮細(xì)胞(圖1P)中TRIM26 均有表達(dá),但在以上這些組織中,乳腺小葉上皮細(xì)胞和胰島細(xì)胞中TRIM26 表達(dá)較強(qiáng)。

2.2 TRIM26 在人體主要組織器官中的相對(duì)表達(dá)水平

根據(jù)BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù)中的Gene Atlas U133A,gcrma 數(shù)據(jù)集,以數(shù)據(jù)庫(kù)中TRIM26 表達(dá)量最低的卵巢組織為1,其它組織器官按其相對(duì)表達(dá)量作圖。TRIM26 在人的主要組織器官上的mRNA 表達(dá)量見(jiàn)圖2。 TRIM26 在氣管、肝和甲狀腺上的表達(dá)水平較高,并且該基因在胰島細(xì)胞上的表達(dá)量高于其在胰腺組織上的表達(dá)量。

2.3 IHC 揭示小鼠主要組織器官中TRIM26 表達(dá)譜

對(duì)小鼠組織的IHC 染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分,染色呈深棕色為強(qiáng)表達(dá),不著色為不表達(dá)。 IHC 結(jié)果分析顯示,TRIM26 在小鼠細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有表達(dá)(圖3)。 TRIM26 表達(dá)于食管鱗狀上皮細(xì)胞及附屬腺體(圖3A)、胃上皮細(xì)胞(圖3B)、小腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞(圖3C、3D)、胰島細(xì)胞及外分泌腺(圖3E)、腦神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞(圖3F)、細(xì)小支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞(圖3G)、腎小管上皮細(xì)胞和腎小球細(xì)胞(圖3H)以及子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(圖3I)。

2.4 RT-qPCR 揭示TRIM26 在小鼠主要組織器官中的表達(dá)水平

RT-qPCR 檢測(cè)了TRIM26 在小鼠組織中的表達(dá)量,結(jié)果如圖4 所示。 選擇在小鼠組織中表達(dá)量最低的心臟為1,其它組織器官按其相對(duì)表達(dá)量作圖。結(jié)果顯示,TRIM26 在小鼠的脾、肺和胰腺組織上的表達(dá)量相對(duì)較高。

圖1 TRIM26 在人體主要組織器官中的表達(dá)Note.A, Esophagus.B, Stomach.C, Small Intestine.D, Colon.E, Liver.F, Pancreas.G, Brain.H, Trachea.I, Lung.J, Spleen.K, Kidney.L, Ovary.M, Endometrium.N, Thyroid.O, Breast.P, Skin.Figure 1 Expression of TRIM26 in human tissues and organs

圖2 TRIM26 在人體主要組織器官中的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 The relative expression of TRIM26 in human tissues and organs

3 討論

本研究通過(guò)IHC 和RT-qPCR 明確了TRIM26基因在人和小鼠主要組織器官中的表達(dá)定位及相對(duì)表達(dá)量。 研究發(fā)現(xiàn),TRIM26 在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),且多表達(dá)于上皮細(xì)胞,其表達(dá)定位在人和小鼠的主要組織器官中具有高度的一致性,同時(shí)表達(dá)于食管鱗狀上皮,胃、小腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞,胰島細(xì)胞,腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞和子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞等。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,TRIM 蛋白參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5],這與蛋白在組織中的表達(dá)與定位密切 相 關(guān)。 在 結(jié) 直 腸 癌 中,Williams 等[14]發(fā) 現(xiàn)TRIM26 通過(guò)泛素化調(diào)節(jié)NTH1 實(shí)現(xiàn)人結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激敏感性的調(diào)控；本研究證實(shí),TRIM26 在人和小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞上有表達(dá),可進(jìn)一步通過(guò)基因修飾小鼠探究該基因在結(jié)直腸癌進(jìn)程中的調(diào)控方式。 Wang 等[17]發(fā)現(xiàn)TRIM26 在肝癌臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)水平量明顯下調(diào),且該基因表達(dá)缺失與肝細(xì)胞癌的惡性程度密切相關(guān)；本研究中,TRIM26 表達(dá)于肝細(xì)胞胞質(zhì)中,以上結(jié)果提示TRIM26 可能發(fā)揮抑癌基因的功能,降低該基因在肝細(xì)胞上的表達(dá)水平,可接下來(lái)探討其表達(dá)缺失與肝癌發(fā)生的相關(guān)性。另外,趙學(xué)英等[18]和李振強(qiáng)等[19]分別在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和沉默TRIM26 表達(dá),證實(shí)TRIM26 正向調(diào)控了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,并與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。 本研究發(fā)現(xiàn),TRIM26 在人和小鼠的腦膠質(zhì)細(xì)胞中均有較強(qiáng)的表達(dá),這提示TRIM26 在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)水平變化可能引起細(xì)胞功能的改變。 由此可見(jiàn),明確TRIM26 的表達(dá)定位與表達(dá)水平在研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重大意義。 然而,目前對(duì)于TRIM26 在人和小鼠主要組織器官中的功能還知之甚少,還有待進(jìn)一步深入研究。

圖3 TRIM26 在小鼠主要組織器官中的表達(dá)Note.A, Esophagus.B, Stomach.C, Small Intestine.D, Colon.E, Pancreas.F, Brain.G, Lung.H, Kidney.I, Endometrium.Figure 3 The expression of TRIM26 in different tissues and organs of mice

圖4 TRIM26 在小鼠主要組織器官中的相對(duì)表達(dá)量Note.WAT, White adipose tissue.Figure 4 The relative expression of TRIM26 in different tissues and organs of mice

此外,本研究發(fā)現(xiàn)TRIM26 在胰島細(xì)胞上的表達(dá)尤為明顯,IHC 結(jié)果顯示,該基因在胰島細(xì)胞上的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于胰腺外分泌腺細(xì)胞,在小鼠胰腺上亦得到了類(lèi)似的結(jié)果。 可見(jiàn),TRIM26 在胰島細(xì)胞上可能發(fā)揮重要而特殊的功能。 根據(jù)此結(jié)果,本課題組已委托南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院構(gòu)建了TRIM26 條件性基因敲除小鼠,擬再與Pdx-Cre 小鼠交配,獲得胰島 β 細(xì)胞特異性敲除TRIM26 的C57BL/6 小鼠,進(jìn)而探究該基因在胰島細(xì)胞上的功能。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)成人組織與成年小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),TRIM26 表達(dá)具有一定的組織器官特異性,提示其功能的復(fù)雜性和組織器官依賴(lài)的特征。 為深入探究TRIM26 在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中承擔(dān)的生物學(xué)功能,本課題組將利用小鼠進(jìn)一步明確TRIM26 在胚胎發(fā)育至老齡化過(guò)程中的不同時(shí)期、不同組織器官中RNA 表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量的變化,完善該基因在不同時(shí)間與空間的表達(dá)譜和功能譜,不僅為后續(xù)探索TRIM26 基因在組織發(fā)育中的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)對(duì)于利用基因修飾小鼠闡明該基因在研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用也是十分重要的。