李嫻靜，儲(chǔ)順禮，熊成立，郝 爽，莫娟萍，張 煒，丁 典，鄭 云，王景云

1993年，Buser等[1]在Nyman等[2]提出的引導(dǎo)組織再生理論的基礎(chǔ)上開(kāi)創(chuàng)了引導(dǎo)骨再生概念(guided bone regeneration, GBR)，即利用屏障膜的隔離作用阻止干擾骨形成的纖維結(jié)締組織進(jìn)入骨缺損區(qū)，為骨缺損的愈合創(chuàng)造空間和條件，實(shí)現(xiàn)骨缺損區(qū)的修復(fù)性再生。GBR技術(shù)是現(xiàn)今臨床應(yīng)用較為廣泛的骨增量手段之一[3]，其核心是屏障膜。發(fā)展至今，屏障膜經(jīng)歷了材料和性能的不斷更替。第一代屏障膜為不可吸收膜，包括膨體聚四氟乙烯(expanded polytetra-fluoroethylene, e-PTFE)膜、鈦增強(qiáng)e-PTFE膜、聚四氟乙烯(polytetra-fluoroethylene，PTFE)膜和鈦網(wǎng)[4-5]，但其需要二次手術(shù)移除且膜暴露風(fēng)險(xiǎn)較高，故增加了繼發(fā)感染和干擾骨再生的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。第二代屏障膜為可吸收膜，包括天然和合成可吸收膜，如膠原膜、殼聚糖膜、聚乳酸(polylactic acid, PLA)膜和聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)膜等[8]。這些膜由于良好的細(xì)胞相容性、生物相容性、低抗原性，彌補(bǔ)了第一代屏障膜的缺陷。然而不可避免的，可吸收膜也存在著諸如降解速度與成骨時(shí)間不匹配、機(jī)械性能不佳等缺點(diǎn)[9]，從而影響成骨效果。綜上，為提高骨再生效果，彌補(bǔ)上一代屏障膜的不足，第三代改性屏障膜成為現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)。屏障膜的改性方法多種多樣，如搭載抗生素提高抗菌性[10]，加入骨替代材料促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)[11]，引入成骨相關(guān)的生長(zhǎng)因子提高骨再生的效果[12]，其中負(fù)載生長(zhǎng)因子的屏障膜成骨誘導(dǎo)和成骨促進(jìn)作用頗為突出，廣泛地出現(xiàn)在各類屏障膜改性的成骨研究中。本文將對(duì)屏障膜搭載生長(zhǎng)因子的種類、負(fù)載方式、生長(zhǎng)因子的釋放及其成骨效果進(jìn)行綜述，對(duì)其前景進(jìn)行剖析，為屏障膜的進(jìn)一步改性提供方向。

1 促進(jìn)骨再生的生長(zhǎng)因子及其作用

生長(zhǎng)因子是一種天然多肽，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和分化，可與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)成骨相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[13]。骨再生的不同階段均需要生長(zhǎng)因子參與調(diào)節(jié)，包括炎癥階段、血運(yùn)重建與血管再生階段、肉芽組織形成階段、骨礦化與再吸收階段及骨改建階段[14]。已有大量研究使用骨缺損模型證實(shí)了骨形態(tài)發(fā)生蛋白[15](bone morphogenetic protein，BMP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[15](vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子[16](platelet derived growth factor，PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[17](fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子[18](insulin like growth factor，IGF)在促進(jìn)骨再生方面的巨大潛力。以下，我們將重點(diǎn)介紹BMP、VEGF、PDGF-BB和FGF。

1.1 BMP

骨形態(tài)發(fā)生蛋白屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族[19]，在骨形成與再生中發(fā)揮著重要的作用[20]。目前，已發(fā)現(xiàn)大約20種BMP，但并非全部都有成骨促進(jìn)作用[21]。BPM-2是目前研究較廣泛，有可靠的成骨誘導(dǎo)作用的生長(zhǎng)因子之一[22]。BMP-2參與骨再生的全部過(guò)程，在炎癥階段由脫顆粒的血小板及巨噬細(xì)胞釋放，作為促炎因子行使功能；在血管再生階段與VEGF協(xié)同促進(jìn)血管生成；在肉芽組織生成階段，調(diào)節(jié)愈合級(jí)聯(lián)反應(yīng)；在骨礦化與再吸收階段，由成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌并驅(qū)動(dòng)骨形成；在骨重建階段，可誘導(dǎo)新骨的形成[23]。目前，使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的人類重組BMP-2(rhBMP-2)已被廣泛地應(yīng)用于骨缺損和組織缺損的治療中[24]。

1.2 VEGF

VEGF屬于同型二聚體蛋白家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor, PlGF)[25]。VEGF是骨再生進(jìn)程血管再生階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)骨形成細(xì)胞的募集[26]，從而協(xié)調(diào)血管再生和骨再生。研究證明給予外源性VEGF可增加骨缺損區(qū)內(nèi)骨的礦化[27-28]。

1.3 PDGF

PDGF有多種亞型，包括AA、BB、AB、CC、DD，可通過(guò)結(jié)合兩種不同親和力的受體(α和β)而發(fā)揮作用。PDGF-BB由于其可與所有已知的同型受體結(jié)合而被認(rèn)為是PDGF的代表[29]。PDGF具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加血管再生活性及調(diào)節(jié)細(xì)胞功能等特性，在骨再生進(jìn)程中能夠增加間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量[30]，刺激其分化為成骨細(xì)胞[31]，從而促進(jìn)新骨形成。

1.4 FGF

FGF家族至少由7個(gè)亞型，23種調(diào)節(jié)骨生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組成[32]。FGF參與骨再生中成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)[33]，協(xié)調(diào)血管生成，在骨祖細(xì)胞膜內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有重要作用[34]。但FGF對(duì)骨再生的影響具有兩面性，高劑量FGF會(huì)抑制骨形成，低劑量可增加骨形成[35-36]。

2 負(fù)載方式

如前所述，大多數(shù)的生長(zhǎng)因子具有可靠的成骨促進(jìn)作用，然而由于其具有爆發(fā)釋放特性及在損傷區(qū)的快速清除特性，若無(wú)理想的呈遞載體將會(huì)帶來(lái)極大應(yīng)用安全隱患及成本負(fù)擔(dān)[14]。許多合成或天然的生物材料，如膠原蛋白、聚乳酸聚乙二醇等被發(fā)現(xiàn)可作為呈遞生長(zhǎng)因子的載體。故生長(zhǎng)因子負(fù)載的屏障膜多選擇天然可吸收屏障膜和合成可吸收屏障膜，如膠原膜、殼聚糖膜、聚乳酸膜(PLA膜)、聚乙交酯膜(PGA膜)。目前主要的負(fù)載方式按操作方法分有三種，即浸泡孵育法、溶液凍干法及制膜液添加法；按結(jié)合方式分包括化學(xué)結(jié)合與物理包埋。其中化學(xué)結(jié)合雖比物理包埋提供更長(zhǎng)時(shí)間的釋放，但由于蛋白質(zhì)的偶聯(lián)可能導(dǎo)致活性官能團(tuán)的損害而喪失生長(zhǎng)因子的生物活性，目前多用于支架材料生長(zhǎng)因子的負(fù)載[37]，屏障膜負(fù)載生長(zhǎng)因子多采用物理包埋的方式。

2.1 浸泡孵育法

浸泡孵育法是將屏障膜浸泡在生長(zhǎng)因子溶液中，經(jīng)一定時(shí)間孵育，使生長(zhǎng)因子吸附于膜上。目前孵育時(shí)間沒(méi)有明確規(guī)定，最短的為5 min，最長(zhǎng)的可達(dá)24 h。Fujioka-Kobayashi等[38]將BMP-2和BMP-9與豬心包膠原膜(porcine pericardium collagen membranes，PPCM)和豬真皮衍生膠原膜(porcine dermis-derived collagen membranes，PDCM)浸泡并孵育5 min，負(fù)載量約達(dá)90%。Hong等[39]將FGF-2滴加到膜上并于室溫下孵育2 h，負(fù)載量約達(dá)50%。Lee等將肝素化的PCL/明膠復(fù)合纖維膜浸泡于FGF-2溶液中，室溫下孵育24 h，負(fù)載率最高約達(dá)58.6%。目前，關(guān)于孵育時(shí)間及孵育溶液濃度與負(fù)載至屏障膜的生長(zhǎng)因子含量間的相關(guān)性尚無(wú)研究證據(jù)。

2.2 溶液凍干法

溶液凍干法是將屏障膜先浸泡于生長(zhǎng)因子溶液中，隨后對(duì)其進(jìn)行凍干操作，使生長(zhǎng)因子負(fù)載于膜上。Du等[40]將bFGF和BMP-2溶液涂布于脫細(xì)胞真皮基質(zhì)膜(acellular dermal matrix membrane，ADMM)4 ℃條件下過(guò)夜，隨后在-60 ℃凍干，成功將0.5 mL 200 ng/mL bFGF和800 ng/mL BMP-2負(fù)載至ADMM上。Mozgan等[41]將BioGide?膠原膜浸泡在富含生長(zhǎng)因子的血小板制劑中并在-80 ℃條件下凍干，成功將多種生長(zhǎng)因子負(fù)載于膠原膜上。

2.3 制膜液添加法

制膜液添加法是在屏障膜制作過(guò)程中將生長(zhǎng)因子添加入制膜聚合物溶液中，隨后進(jìn)行成膜操作，此后制備好的屏障膜即有生長(zhǎng)因子負(fù)載。Lee等[42]將PDGF-BB水溶液按比例加入到左旋聚乳酸-磷酸三鈣(poly(L-lactic acid-tertiary)-calcium phosphate，PLLA-TCP)聚合物溶液中，混合均勻后澆鑄于模具上干燥成形，從而獲得負(fù)載生長(zhǎng)因子的聚合膜。Ho等[43]將PDGF溶液添加入外消旋聚乳酸(poly-DL-lacide， PDLLA)溶液中，攪拌24 h后采用靜電紡絲技術(shù)在成品膠原膜表面形成負(fù)載有生長(zhǎng)因子的納米纖維層功能面。

3 改性屏障膜生長(zhǎng)因子的釋放

骨再生的過(guò)程歷時(shí)較長(zhǎng)，生長(zhǎng)因子參與調(diào)控其全部過(guò)程，但生長(zhǎng)因子穩(wěn)定性較低且體內(nèi)半衰期較短，GBR膜作為生長(zhǎng)因子的局部控釋系統(tǒng)[44],保證生長(zhǎng)因子持續(xù)穩(wěn)定的釋放是其改性的關(guān)鍵。大量的研究證實(shí)負(fù)載生長(zhǎng)因子的屏障膜生長(zhǎng)因子的釋放分為兩個(gè)階段，即爆發(fā)釋放期、平臺(tái)期。Takayama等[45]將膠原膜負(fù)載基質(zhì)衍生因子-1(stromal cellderived factor-1， SDF-1)21 d內(nèi)觀察其生長(zhǎng)因子釋放量，在最初的1 d內(nèi)即觀察到生長(zhǎng)因子的爆發(fā)釋放，隨后進(jìn)入平臺(tái)期，生長(zhǎng)因子釋放濃度趨于平穩(wěn)。Kim等[46]采用浸漬沉淀技術(shù)制備葉片堆疊結(jié)構(gòu)膜(leaf-stacked structure membrane， LSS膜)，將該膜與Osteoguide?分別采用浸泡孵育法負(fù)載BMP-2，最終在成品膜組觀察到前6 d BMP-2的爆發(fā)釋放，占73%的負(fù)載量，而LSS膜組觀察到BMP-2的持續(xù)釋放無(wú)顯著爆發(fā)性釋放特征，38 d內(nèi)釋放負(fù)載量的62%。這種差異可用材料表面的特殊結(jié)構(gòu)對(duì)生長(zhǎng)因子的再吸附來(lái)解釋。Khorsand等[47]將編碼BMP-2基因的納米復(fù)合物負(fù)載于膠原膜，通過(guò)觀察其在模擬體液中的釋放發(fā)現(xiàn)在最初的24 h大約65%～75%的納米復(fù)合物被釋放，并在隨后的4 d里持續(xù)緩慢釋放。Shim等[48]通過(guò)更長(zhǎng)時(shí)間的觀察發(fā)現(xiàn)其采用3D打印方法制備的負(fù)載rhBPM-2復(fù)合材料屏障膜在最初的24 h經(jīng)歷爆發(fā)釋放后，穩(wěn)定的持續(xù)釋放期達(dá)28 d，能夠滿足更長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)成骨需求。

4 負(fù)載生長(zhǎng)因子屏障膜的成骨療效

屏障膜負(fù)載生長(zhǎng)因子的最終目的是獲得比單純應(yīng)用屏障膜更可靠的骨再生效果，加快骨再生的速度。應(yīng)用時(shí)負(fù)載生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的增殖、分化，骨形成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平可靠的促進(jìn)作用是評(píng)價(jià)其成骨療效的標(biāo)準(zhǔn)。Kim等[46]對(duì)負(fù)載BMP-2的屏障膜與人骨膜來(lái)源細(xì)胞共培養(yǎng)并進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測(cè)、RUNX-2表達(dá)水平檢測(cè)、體內(nèi)再生骨量的檢測(cè)，結(jié)果顯示負(fù)載生長(zhǎng)因子的屏障膜各項(xiàng)指標(biāo)均顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用的屏障膜。Fujioka-Kobayashi等[38]對(duì)比負(fù)載BMP-2和rhBMP-9的膠原膜與單純應(yīng)用膠原膜時(shí)小鼠基質(zhì)細(xì)胞的成骨指標(biāo)，負(fù)載生長(zhǎng)因子的膜顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞堿性磷酸酶活性，更高水平的骨鈣素表達(dá)，更高量的鈣化結(jié)節(jié)生成?，F(xiàn)有的關(guān)于負(fù)載生長(zhǎng)因子的屏障膜相關(guān)研究在細(xì)胞堿性磷酸酶活性、成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平及鈣化結(jié)節(jié)生成量上均顯著高于單純應(yīng)用屏障膜，這提示了屏障膜作為生長(zhǎng)因子載體的可靠性。

5 總結(jié)與展望

目前，臨床應(yīng)用的可吸收屏障膜已經(jīng)日趨成熟，但由于不同病例骨缺損修復(fù)的需求，急需擴(kuò)大其臨床適應(yīng)證，并確保成骨的療效，仍需對(duì)現(xiàn)有可吸收屏障膜如膠原膜、殼聚糖膜、PLA膜的促成骨方向改性進(jìn)行探索，生長(zhǎng)因子的體內(nèi)外促成骨能力已被大量研究證實(shí)，將生長(zhǎng)因子對(duì)骨形成相關(guān)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其可靠的促成骨能力與屏障膜有機(jī)結(jié)合是當(dāng)前骨再生領(lǐng)域研究的新思路，但如何控制體內(nèi)條件下負(fù)載生長(zhǎng)因子屏障膜中生長(zhǎng)因子的釋放仍是急需攻克的難題，由于釋放受擴(kuò)散條件的限制，如pH、蛋白酶、外部磁場(chǎng)等，期望未來(lái)通過(guò)對(duì)屏障膜材料各種物理化學(xué)參數(shù)的改性及釋放條件的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子的控釋。另外負(fù)載生長(zhǎng)因子屏障膜的成本問(wèn)題也是其臨床應(yīng)用的障礙，未來(lái)尚需研究如何降低生長(zhǎng)因子的生產(chǎn)成本及負(fù)載成本，從而獲得適應(yīng)證廣泛、性價(jià)比高、骨再生效果明顯的新一代屏障膜。