王藝芳，葛文超，李俊英，呂永磊，方建華

（河南省紅十字血液中心，河南 鄭州450012）

按照《血站實驗室質(zhì)量管理規(guī)范》[1]和《血站技術(shù)操作規(guī)程（2015 版）》[2]的要求，檢測設(shè)備在正式投入使用之前應(yīng)經(jīng)過確認，核酸檢測（nucleic acid test, NAT）設(shè)備還應(yīng)進行分析靈敏度驗證，實驗室應(yīng)建立血液檢測試劑的評價、選擇和確認程序。 因此，在核酸檢測設(shè)備投入使用前，需要通過性能確認了解其性能，確認是否達到預(yù)期，滿足實驗室日常檢測需要。 浩源核酸檢測系統(tǒng)于2018 年7 月份引進本實驗室，筆者通過通量測試、壓力測試、靈敏度驗證和平行試驗等方面,完成對浩源核酸檢測系統(tǒng)性能的評估,為其他實驗室的核酸檢測系統(tǒng)性能確認工作提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2018 年08 月本中心采集的無償獻血者標(biāo)本。 獻血者均符合國家《獻血者健康檢查要求》中的相關(guān)要求。 采集每人份血液同時留取酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）樣管和NAT 樣管，其中NAT 標(biāo)本在采樣后4h 內(nèi)于2~8 ℃1760g 離心20 min,2~8℃保存，24h 內(nèi)上機進行檢測。

1.2 主要試劑、 儀器和NAT 試劑廠家 乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒（1 型）核酸檢測試劑盒（上海浩源生物科技有限公司, 批號：MF2 0180101）;乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒（1+2 型）核酸檢測試劑盒（蘇州華益美生物科技有限公司，批號：MA20180403 等）。 配套耗材均由試劑公司提供，均在有效期內(nèi)使用。 核酸檢測使用：ChiTaSBSS1200 核酸提取系統(tǒng)（美國PE公司）,Hamilton Star 全自動混樣儀（瑞士HAMILTON 公司），ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）,低溫大容量離心機KUBOTA 8730（日本KUB OTA 公司）。

1.3 血清盤 北京康徹斯坦核酸系列血清評價盤(系統(tǒng)性能驗證盤), 有36 份編號為P 系列樣本,其中包括HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA 及陰性的樣本，見表1，進行8 人份混樣檢測。北京康徹斯坦核酸系列血清評價盤（分析靈敏度）, 分別由WHO HBV DNA 標(biāo)準(zhǔn)品（10/26 4）稀釋至9 IU/ml（6 個）、6 IU/ml（20 個）、3 IU/ml（6 個），WHO HCV RNA 標(biāo)準(zhǔn)品（06/102）稀釋至36 IU/ml（6 個）、24 IU/ml（20 個）、12 IU/ml（6 個），WHO HIV RNA-1標(biāo)準(zhǔn)品（10/152）稀釋至72 IU/ml（6 個）、48 IU/ml（20 個）、24 IU/ml（6 個），進行單人份檢測。

1.4 方法

1.4.1 通量測試 14h 內(nèi)連續(xù)進行兩個批次的8 混檢模式檢測，每個批次均是滿負荷，含質(zhì)控品和樣本。 所用樣本為實驗室當(dāng)日檢測過的樣本，以驗證在滿負荷連續(xù)運行14h 內(nèi)的檢測量。

1.4.2 壓力測試 使用浩源核酸檢測系統(tǒng)進行8 混檢模式檢測,連續(xù)運行檢測3d,共計檢測樣本2 232份（未包含質(zhì)控品），觀察并記錄檢測系統(tǒng)的滿負荷的運行狀況以驗證在長時間運行時的系統(tǒng)穩(wěn)定性。

1.4.3 分析靈敏度驗證 使用浩源核酸檢測系統(tǒng)對分析靈敏度血清評價盤進行單檢模式檢測，將HBV、HCV 和HIV-1 3 種病毒標(biāo)準(zhǔn)品隨機分布進行檢測， 并用IBM SPSS Statistics 19 分別分析其95%檢出限。

1.4.4 平行試驗 使用2018 年8 月6 日-11 日華益美檢測過的樣本進行檢測。

1.4.5 抗交叉污染 使用13 個陰性血漿樣本和53個陽性血漿樣本 （含HBV、HCV、HIV 強陽性或弱陽性樣本），交替放置8 混檢模式檢測。

1.4.6 檢測能力驗證 采用浩源核酸檢測系統(tǒng)對康徹斯坦血清盤進行8 混檢模式進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 通量測試 1 臺浩源核酸檢測系統(tǒng)在14h 內(nèi)可以完成1 488 份樣本的混樣模式檢測，運行過程中無故障發(fā)生。

2.2 壓力測試 每天進行744 份樣本混樣模式檢測,連續(xù)3d，模擬實際運行過程中最大的檢測壓力,在滿負荷狀態(tài)下連續(xù)運行3d，無故障和無效結(jié)果。

2.3 分析靈敏度驗證 分析靈敏度驗證的結(jié)果見表2，單人份檢測HBV DNA 95%檢出限為6.00 IU/ml，HCV RNA 95%檢 出 限 為24.00 IU/ml，HIV RNA-1 95%檢出限為48.00 IU/ml。

2.4 平行試驗 使用華益美檢測過的樣本進行檢測，有1 個pool 浩源混檢陽性而華益美混檢陰性，拆分陰性，其他結(jié)果均一致。

2.5 抗交叉污染 66 個樣本試驗，53 個陽性樣本均檢測為有反應(yīng)性，13 個陰性樣本均為無反應(yīng)性。陽性孔均未對鄰近孔位造成交叉污染。

2.6 檢測能力驗證 對康徹斯坦血清盤進行8 混檢模式進行檢測,檢測結(jié)果與血清盤說明書參考結(jié)果符合度100%。 見表1。

3 討論

病毒核酸檢測技術(shù)是直接檢測病原體核酸的一系列技術(shù)的總稱。 相比酶聯(lián)免疫檢測方法，血液病毒核酸檢測技術(shù)可以有效縮短抗原抗體免疫檢測的“窗口期”，從而大大降低經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險[3-6]。 目前全國血站核酸檢測工作已逐步在各地區(qū)普及[7]，更多的實驗室關(guān)注核酸檢測的質(zhì)量更加注重核酸檢測系統(tǒng)性能確認工作。 國際輸血協(xié)會（International Society Blood Transfusion，ISBT）指出安裝確認（IQ）、運行確認（OQ）、性能確認（PQ）是設(shè)備確認的3 個連續(xù)階段,并對具體操作進行了說明[8]。 本實驗室在實施性能確認前對安裝調(diào)試完畢的浩源核酸系統(tǒng)的設(shè)備已進行評估,確保設(shè)備硬件和軟件的正確安裝,設(shè)備在可要求的范圍內(nèi)正確運行。 目前，全自動NAT 儀器這樣的大型儀器IQ和OQ 通常由廠商的工程技術(shù)人員進行，而PQ 則需實驗室的設(shè)備使用人員來完成[9]。

表1 36 份編號為P 系列樣本背景清單

表2 浩源核酸檢測系統(tǒng)對WHO 標(biāo)準(zhǔn)品分析靈敏度的驗證結(jié)果

通過驗證操作性能（通量測試和壓力測試）和檢測性能（靈敏度驗證、平行試驗、抗交叉污染和檢測能力）兩個方面[10]，設(shè)計確認方案完成對浩源核酸檢測系統(tǒng)性能的評估。 通量測試是實驗室對浩源核酸檢測系統(tǒng)檢測量和檢測時間有一個預(yù)估計,14h 內(nèi)可完成1 488 份樣本的8 混檢模式檢測，為今后日常檢測合理安排工作提供依據(jù)。 使用浩源核酸檢測系統(tǒng)進行8 混檢模式檢測,由于平常實驗室檢測量較大,在壓力測試測評價中模擬實際運行過程中最大的檢測壓力，并連續(xù)檢測，以此驗證了檢測系統(tǒng)的滿負荷運行狀況以在長時間運行時的系統(tǒng)穩(wěn)定性。 靈敏度驗證方面，參考ELISA 弱陽性質(zhì)控品來監(jiān)控試驗的有效性和穩(wěn)定性[11]，監(jiān)控系統(tǒng)的趨勢變化。按照規(guī)程要求，結(jié)合NAT 自身特點和靈敏度血清盤結(jié)果, 筆者認為選擇最低檢測限0.5~2 倍檢出限的NAT 標(biāo)準(zhǔn)品作為分析靈敏度驗證的陽性樣本,其病毒含量明確，一致性較好，相對于日常檢測的血液樣本,更適用于新儀器的靈敏度檢測確認。 由表2 可知,分析靈敏度驗證HBV DN A、HCV RNA 和HIV RNA-1 95%檢出限為分別為6.00 IU/ml、24.00 IU/ml、48.00 IU/ml， 這與試劑說明書基本相符。 平行試驗評價采用另外一套系統(tǒng)當(dāng)日檢測過的樣本進行檢測， 僅有1 個pool 混檢陽性，經(jīng)拆分后為陰性，并在前一套系統(tǒng)內(nèi)重復(fù)檢測，均為陰性。 分析原因：可能由于檢測方案、靈敏度的不同，出現(xiàn)了檢測結(jié)果的差異。由于NAT 防污染是必須重視的1 個問題[12]，實驗室在進行抗交叉污染評價之前，首先進行了防污染監(jiān)控確認，確保實驗室環(huán)境、設(shè)備無污染。 其次將陽性（含HBV、HCV、HIV 強陽性或弱陽性樣本） 和陰性樣本混合交叉排列進行交叉污染的評估,可以有效的驗證儀器在匯集、 提取和擴增過程中對待測樣本的處理是否存在交叉污染[13]，便于日后出現(xiàn)多孔位反應(yīng)性時，排除系統(tǒng)原因，分析污染原因。 系統(tǒng)性能驗證血清盤是一組含有陰性、強陽性、弱陽性樣本以及常見基因型樣本，通過混樣檢測，對檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性、基因型覆蓋面、弱陽性樣本的檢測能力、防交叉污染能力等方面進行綜合評價， 其檢測性能符合實驗室日常檢測要求。

通過性能確認,我們對浩源核酸檢測系統(tǒng)的綜合性能有了全面的了解,其操作性能和檢測性能基本符合實驗室日常檢測要求。 同時，根據(jù)實驗室日常的檢測量和檢測成本,在設(shè)計核酸檢測系統(tǒng)的確認方案時，除考慮滿足法律法規(guī)外，還應(yīng)參加NAT室間質(zhì)評實驗室能力評價活動,作為性能確認工作的補充，并對這一系列確認活動形成確認報告。