徐珂

（開封市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 開封475000）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，影響關(guān)節(jié)、結(jié)締組織、肌肉及纖維組織，還可引起骨和軟骨的變形[1]。 Th1/Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是RA 的重要發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞因子TNF、IL-6、IL-17 等是RA 發(fā)病的關(guān)鍵成分。 心血管疾病是RA 患者最常見的并發(fā)癥之一, 它使RA 的死亡率增加了兩倍[2]，RA 患者中系統(tǒng)性動(dòng)脈高壓（SAH）的患病率高達(dá)53%~73%, 而一般人群中不超過(guò)23%[3]。 最近的研究突出了炎癥在高血壓發(fā)展中的作用，先天性免疫、效應(yīng)性和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及共刺激分子與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)相互作用，參與高血壓的發(fā)生[4]。

對(duì)RA 合并癥的治療，如SAH，優(yōu)選血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和/或血管緊張素II 受體阻斷劑[5]。在對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎大鼠的研究中,纈沙坦可抑制Th1 相關(guān)的細(xì)胞因子水平并顯著正向調(diào)節(jié)Th2 相關(guān)細(xì)胞因子, 證明纈沙坦可以作為Th細(xì)胞亞群平衡的調(diào)節(jié)劑[6]，另一方面，氯沙坦在心血管疾病患者中能夠降低IL-6 的水平和增加TGF-β 的產(chǎn)生[7]。 還有些研究發(fā)現(xiàn)，依那普利是一種弱免疫調(diào)節(jié)劑[8]。顯然這些藥物除了控制血壓外,還有不同程度的免疫調(diào)節(jié)作用，但它們對(duì)RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的作用尚不清楚。 本研究旨在探討氯沙坦、依那普利和纈沙坦對(duì)RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17 和IL-22 的影響，并探討其與疾病活動(dòng)性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取開封市人民醫(yī)院于2017 年1月至2018 年1 月收治的RA 患者20 例,均符合20 10 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)RA 的分類標(biāo)準(zhǔn)[9]，所有入選病例排除其他風(fēng)濕性疾病、心血管、內(nèi)分泌、甲狀腺、免疫調(diào)節(jié)性疾病和癌癥,收集患者的臨床資料，見表1。 根據(jù)患者疾病活動(dòng)評(píng)分（DAS28）評(píng)價(jià)患者疾病的活動(dòng)度。DAS28<3.2 為低度活動(dòng)，3.2~5.1 為中度活動(dòng),>5.1 為高度活動(dòng)。 研究對(duì)象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-22 檢測(cè)ELISA 試劑盒購(gòu)自默沙克生物科技有限公司。Ficoll-Hypaque 和抗CD3、抗CD28 單克隆抗體購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 無(wú)菌條件下抽取患者空腹靜脈血30ml，除了常規(guī)的血常規(guī)、類風(fēng)濕因子、血沉等檢測(cè)外，還做以下實(shí)驗(yàn)。

將RA 患者的外周血在無(wú)菌條件下,用Ficoll-Hypaque 密度梯度離心分離,磷酸緩沖液洗滌2 次,計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度為1×106/ml 接種于6 孔板， 每孔1ml。 設(shè)不加抗體的細(xì)胞為空白對(duì)照,用抗CD3 和抗CD28 單抗刺激細(xì)胞，刺激后不加藥物的為刺激組，刺激后加100μm 甲基強(qiáng)的松龍為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組分別加入100μm 氯沙坦、纈沙坦和依那普利,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。 各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，收集上清液放于-80℃冰箱儲(chǔ)存。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書指示測(cè)定上清液中的細(xì)胞因子濃度。 IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-22 的 最 低 檢 測(cè) 量 分 別 是4.0、4.69、4.69、9.38、18.75 和6.0 pg/ml。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 軟件分析，計(jì)量資料以x±s 表示， 兩組間比較應(yīng)用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA 患者臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù) 20 例RA 患者均符合2010 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)RA 的分類標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)DAS28 對(duì)患者疾病活動(dòng)進(jìn)行定量, 收集臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，見表1。

表1 RA 患者臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)

2.2 抗高血壓藥物對(duì)RA 患者PBMCs 的影響 與刺激組相比，氯沙坦顯著降低RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-6、IL-17 和IL-22的濃度(P=0.005;0.000;0.000;0.000)，依那普利顯著降低IFN-γ、IL-22 的濃度(P=0.009;0.002)，纈沙坦沒(méi)有降低相關(guān)細(xì)胞因子的濃度。

2.3 抗高血壓藥物對(duì)RA 患者細(xì)胞因子及疾病活動(dòng)度的影響 對(duì)于DAS28＜3.2 的RA 患者，氯沙坦能使IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17 和IL-22 顯著下降(P=0.025; 0.005; 0.0046; 0.004; 0.035)， 而 對(duì) 于DAS28＞3.2 的RA 患者，氯沙坦能使IL-22 顯著下降（P＝0.002），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，依那普利和纈沙坦治療后細(xì)胞因子的變化和DAS28 無(wú)相關(guān)性。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展與免疫細(xì)胞功能的失衡有關(guān)，包括B 淋巴細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞及其亞群，在RA 發(fā)病機(jī)制中最主要的細(xì)胞因子包括Th1和Th17 細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子。 RA 患者普遍患有心血管疾病, 超過(guò)70%的RA 合并CVC 的患者高表達(dá)炎性免疫學(xué)標(biāo)志物, 包括C 反應(yīng)蛋白等[10]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)有力證明某些抗高血壓藥物具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能,然而這些藥物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病中的潛力尚未證實(shí),我們根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，探討抗高血壓藥物對(duì)RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞與疾病活性相應(yīng)的變化中的作用。

圖1 ELISA 檢測(cè)幾種降壓藥對(duì)RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-2、IL-6、IL-17、IL-22 及IFN-γ 的影響

圖2 100μm 依那普利、氯沙坦和纈沙坦對(duì)不同DAS28 評(píng)分患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22 的影響

RA 中的系統(tǒng)性高血壓患者，治療時(shí)優(yōu)選血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和/或血管緊張素II 受體阻斷劑，這些藥物用于治療心血管疾病效果良好[11]。 心血管危險(xiǎn)因素和全身炎癥與RA 患者頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度的快速進(jìn)展有關(guān),因此有必要檢測(cè)抗高血壓藥物是否參與免疫調(diào)節(jié)作用，這有利于為RA 患者選取更合適的治療方案。本結(jié)果表明，在CD3 和CD28 抗體刺激RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）時(shí),氯沙坦能夠顯著降低PBMC 分泌的IF N-γ、IL-6、IL-17 和IL-22 的濃度, 依那普利和對(duì)PBMC 中促炎因子的產(chǎn)生幾乎沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。

促炎性細(xì)胞因子參與RA 的發(fā)病，IL-17 是其中之一，它存在于滑膜中，能夠加重RA 患者的病情，而且人們發(fā)現(xiàn)，IL-17 在動(dòng)脈高壓的發(fā)病中，對(duì)誘導(dǎo)血管生成因子的產(chǎn)生和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移起著關(guān)鍵的作用[12,13],IL-17 還激活血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶Ⅰ依賴途徑, 引起水和鈉的代謝不平衡，從而升高血壓[14]。 因此，降低循環(huán)水平的IL-17不僅可以改善RA 的癥狀,也有利于高血壓患者血壓的控制。 氯沙坦在100μm 濃度下能夠降低IL-17 的水平, 此外通過(guò)DAS28 對(duì)RA 患者病情進(jìn)行評(píng)估, 氯沙坦能夠降低輕中度患者細(xì)胞因子的水平,但是對(duì)重度評(píng)分的患者無(wú)影響,而依那普利和纈沙坦對(duì)細(xì)胞表達(dá)因子的沒(méi)有影響。

IFN-γ 和IL-6 是兩種具有多種功能的炎性細(xì)胞因子，如促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和參與免疫調(diào)節(jié)，IFN 家族與RA 的發(fā)病有關(guān)，IL-6 也是RA 治療的靶點(diǎn)之一。

IL-6 與C-反應(yīng)蛋白水平、關(guān)節(jié)腫脹程度、DAS 28、類風(fēng)濕因子及抗瓜氨酸抗體相關(guān)。 IL-22 是一種多效細(xì)胞因子, 通過(guò)MAPK/NF-κB 和JAK-2/ST AT-3 信號(hào)通路的激活介導(dǎo)破骨細(xì)胞激活，破環(huán)關(guān)節(jié)軟骨，IL-22 也可能會(huì)成為RA 治療的靶點(diǎn)[15,16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯沙坦顯著降低RA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的IFN-γ、IL-6、IL-17 和IL-22 的濃度，依那普利顯著降低IFN-γ、IL-22 的濃度， 纈沙坦沒(méi)有降低相關(guān)細(xì)胞因子的濃度。 對(duì)DAS28＜3.2 的病人,氯沙坦能使IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17 和IL-22 顯著下降， 而對(duì)于DAS28＞3.2 的病人,氯沙坦能使IL-22 顯著下降。

對(duì)于評(píng)估的所有細(xì)胞因子,我們觀察到疾病活動(dòng)嚴(yán)重的患者（DAS28>3.2）氯沙坦僅能降低IL22的濃度,目前認(rèn)為IL-22 是RA 發(fā)病過(guò)程中關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一,IL22 的反應(yīng)性和ESR、CRP、DAS28及骨損傷程度相關(guān)[17]，所以對(duì)于嚴(yán)重的RA 患者，氯沙坦也有一定的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。 病情嚴(yán)重的患者可能因使用潑尼松等激素抗炎治療而使免疫細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)變得不敏感，但RA 是一種慢性和退行性疾病,很難在不進(jìn)行抗炎的情況下招募患者，這使體外研究更加的困難。 本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備進(jìn)一步選擇RA 合并高血壓，但未用抗高血壓藥物治療的患者，觀察這些患者在加服氯沙坦后，血清IL22等細(xì)胞因子濃度的變化及外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)通路的改變來(lái)明確氯沙坦的作用機(jī)制。

綜上所述，在依那普利、氯沙坦和纈沙坦這三種抗高血壓藥物中,氯沙坦對(duì)RA 患者的PBM C 有免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為RA 合并高血壓的選擇藥物。