姜青龍，曾黎峰，李勝遠(yuǎn)，王征勇，李蓉

（1.江西省臨床檢驗(yàn)中心，江西 南昌330006； 2.江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006）

為加強(qiáng)江西省新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）核酸檢測的質(zhì)量管理，驗(yàn)證各實(shí)驗(yàn)室的檢測能力,保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性, 對37 家臨床基因檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行一次2019-nCoV 核酸檢測室間質(zhì)評活動(dòng)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 廣州邦德盛生物科技有限公司（江西萬點(diǎn)生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)),每家實(shí)驗(yàn)室發(fā)放5個(gè)批號(hào),即：202011,202012,202013,202014,202015;所有質(zhì)控物為假病毒，均冷鏈運(yùn)輸（江西樂成生物科技有限公司惠贈(zèng)）至各實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑 儀器:ABI 系列,DA7600,line-Gene,SLAN； 試劑: 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司，上海伯杰生物科技有限公司，湖南圣湘生物科技有限公司。

1.3 檢測方法 37 家臨床實(shí)驗(yàn)室采用臨床基因擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量法進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用廠家提供靶值，PT 方案評定。

2 結(jié)果

質(zhì)控物分發(fā)給37 家實(shí)驗(yàn)室, 結(jié)果回報(bào)37 家，回報(bào)率100.0%。 2019-nCoV 核酸檢測室間質(zhì)評各批號(hào)質(zhì)控物靶值及實(shí)驗(yàn)室PT 成績合格率見表1。2019-nCoV 結(jié)果Ct 值統(tǒng)計(jì)情況分別見表2 及表3。

表1 各批號(hào)質(zhì)控物靶值及PT 成績合格率

表2 2019-nCoV ORFlab 基因Ct 值概況

表3 2019-nCoV N 基因Ct 值概況

3 討論

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 201 9,COVID-19)是SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致的肺炎。 主要的傳播途徑是呼吸道飛沫傳播和接觸傳播。2019-nCoV 屬套式病毒目,冠狀病毒科,β 冠狀病毒屬[1]。 基因組有30kb 序列,與真核細(xì)胞mRNA 結(jié)構(gòu)非常相似[2]。 當(dāng)前獲批的核酸檢測產(chǎn)品普遍采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法, 檢測靶標(biāo)涉及SARS-CoV-2基因組序列中的核衣殼蛋白（N）基因、開放閱讀框1ab（ORF1ab）基因、包膜蛋白（E）基因、刺突蛋白（S）基因等[3]。 呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本中實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性作為重要的依據(jù)。 同時(shí)，測定SARS-CoV-2 核酸也是與流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒感染等其他病原體鑒別診斷的重要依據(jù)。 經(jīng)治療后，患者出院的標(biāo)準(zhǔn)也將連續(xù)2 次呼吸道病原核酸檢測陰性 （間隔≥24 h）作為解除隔離出院的重要依據(jù)[4]。 對于實(shí)現(xiàn)快速確診感染病例、排除疑似病例，促進(jìn)疫情的防控與臨床救治至關(guān)重要[5]。

3.1 2019-nCoV 肺炎屬乙類傳染病按甲類管理病毒核酸檢測需在二級(jí)生物安全并通過驗(yàn)收的PCR 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,操作人員按三級(jí)生物安全防護(hù)[6]。為了保證安全,本次室間質(zhì)評活動(dòng)質(zhì)控物采用新型冠狀病毒假病毒作為樣本,僅對江西省衛(wèi)健委公布的37 家核酸檢測實(shí)驗(yàn)室分發(fā)了質(zhì)控品，按《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》 第五版要求進(jìn)行檢測。 根據(jù)我省各實(shí)驗(yàn)室使用的2019-nCoV核酸檢測試劑盒可能來源于不同廠商,本次室間質(zhì)評只回報(bào)ORF1ab 基因和N 基因檢測結(jié)果。

3.2 目前各廠商主要提供定性檢測試劑 因本次室間質(zhì)控物為均一物質(zhì), 每支質(zhì)控物病毒含量一致，Ct 值有一定的可比性,并且通過Ct 值可以了解試劑盒的一些相關(guān)性能,所以要求同時(shí)回報(bào)定性結(jié)果和Ct 值。

3.3 結(jié)果的真實(shí)性 本次室間質(zhì)評未提前通知參評實(shí)驗(yàn)室，結(jié)果回報(bào)率為100.0%，體現(xiàn)出各實(shí)驗(yàn)室對室間質(zhì)評的重視。 除202013 和202015 這兩個(gè)批號(hào)合格率為97.3%外，其它三個(gè)批號(hào)合格率均為100.0%，36 家實(shí)驗(yàn)室2019-nCoV 核酸檢測能力均合格,本次室間質(zhì)評成績優(yōu)秀，見表1。

3.4 不同品牌試劑批內(nèi)變異系數(shù)有差異 可能與不同品牌試劑盒引物設(shè)計(jì)不同、各位點(diǎn)檢測靈敏度不同有關(guān)[7],從表2 和表3 可以看出2019-nCoV OR Flab 基因202013 批號(hào)樣本濃度最高，202011 批號(hào)最低；2019-nCoV N 基因202013 批號(hào)樣本濃度最高，202011 批號(hào)最低；達(dá)安基因組、上海伯杰組和其它組結(jié)果均一致。 達(dá)安基因組的產(chǎn)品使用率顯著性高于其它產(chǎn)品, 且中間濃度的Ct 值標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)最小。 上海伯杰在各組中標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)最小，可能是用戶數(shù)量相對較少的原因。

3.5 樣本202012 和202014 為陰性樣本 回報(bào)時(shí)，有5 家實(shí)驗(yàn)室未填報(bào)Ct 值，有7 家回報(bào)“0”，有25家回報(bào)試劑說明書規(guī)定的非特異性擴(kuò)增的最小循環(huán)數(shù)，故未做進(jìn)一步分析；這兩個(gè)批號(hào)結(jié)果反映問題較為一致，所以只列出202012 批號(hào)數(shù)據(jù)。

3.6 循環(huán)閾值Ct 值與病毒模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系[8]相同濃度的樣本不同廠家檢測Ct 值略有不同。 影響檢測結(jié)果Ct 值的因素貫穿整個(gè)試驗(yàn)：靶RNA 降解、提取試劑盒的質(zhì)量，耗材污染、移液器的準(zhǔn)確性、人員操作、儀器擴(kuò)增效率、引物設(shè)計(jì)和結(jié)果判讀等均可以影響Ct 值，見表2、表3。 例如圖1，閾值線選在L1 水平的Ct 值明顯大于L2 水平。 所以，在日常核酸檢測中，實(shí)驗(yàn)室一定要有規(guī)范的管理文件,操作人員嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)化程序文件執(zhí)行，把各種誤差降到最低。

圖1 閾值線對判讀結(jié)果Ct 值的影響

3.7 其它情況 組主要為湖南圣湘，因室間質(zhì)評系統(tǒng)未錄入該試劑信息,所以在回報(bào)過程中歸為其它組。上海復(fù)星組用戶只有1 家,未做分析。在回報(bào)的數(shù)據(jù)中,有1 家實(shí)驗(yàn)室未填寫檢測方法、儀器、試劑等信息，在分組統(tǒng)計(jì)過程中未列入任何組。

3.8 假陰性結(jié)果分析 有一家實(shí)驗(yàn)室202013 和202015 這兩批號(hào)回報(bào)假陰性結(jié)果， 導(dǎo)致這兩批號(hào)合格率為97.3%。 通過查看這家實(shí)驗(yàn)室回報(bào)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)定性結(jié)果檢測方法為 “其它”, 儀器為“DA7600”,只有202011 批號(hào)回報(bào)了Ct 值,其它批號(hào)空白；一方面可能是回報(bào)錯(cuò)誤,另一方面可能是實(shí)驗(yàn)室人員操作不規(guī)范引起的假陰性,也可能是試劑耗材中存在抑制劑或其它因素引起的假陰性。結(jié)合此次檢測結(jié)果和回報(bào)數(shù)據(jù)， 該實(shí)驗(yàn)室存在管理不規(guī)范的問題,希望能通過此次室間質(zhì)評體現(xiàn)出來的問題查找原因。

本次室間質(zhì)評未涉及臨床樣本采集、 運(yùn)送和報(bào)告發(fā)放環(huán)節(jié)，只考核實(shí)驗(yàn)室樣本處理、提取和檢測過程。 在感染者的肺泡灌洗液、鼻腔、痰液、糞便和血液樣本均可用于2019-nCoV 核酸檢測[9]。同一個(gè)病人作為臨床定性檢測項(xiàng)目，采樣時(shí)機(jī)不合適，不同病程、不同病情患者機(jī)體中不同采樣部位病毒載量可能不同[10]。此外2019-nCoV 為RNA 病毒,容易降解，樣本采集后應(yīng)嚴(yán)格按照要求運(yùn)送。

目前新冠病毒所致疾病其病理過程及臨床病程還未完全闡明，實(shí)驗(yàn)室檢測路徑未標(biāo)準(zhǔn)化，加上其核酸檢測試劑盒研發(fā)時(shí)間緊迫,沒有足夠的評估及大樣本量的臨床驗(yàn)證[11]，室間質(zhì)評活動(dòng)對于驗(yàn)證各實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性極其重要，針對此次2019-nCoV 核酸檢測的質(zhì)量管理, 江西省衛(wèi)健委醫(yī)政醫(yī)管處委托江西省臨床檢驗(yàn)中心開展的室間質(zhì)評活動(dòng),表明了省衛(wèi)健委推薦開展冠狀病毒核酸檢測的37 家臨床基因檢測實(shí)驗(yàn)室核酸檢測能力合格,同時(shí)也進(jìn)一步提示了臨床實(shí)驗(yàn)室制定樣本采集及運(yùn)送標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程及對相關(guān)人員進(jìn)行培訓(xùn)，以提高檢測準(zhǔn)確性的重要性和必要性。