閆婭霏，陳 龍，趙嘉慶

微螺釘支抗種植體或微種植體支抗(MIA)作為近幾年國內(nèi)外口腔正畸臨床開展的一項新技術(shù)，其特點是支抗絕對、充分，對患者的依存性要求低，手術(shù)簡單、微創(chuàng)，支抗效果顯著改善[1]。MIA可以縮短正畸治療時間，顯著降低外科手術(shù)病例，與傳統(tǒng)面弓、頭帽等其他矯正相比，具有顯著優(yōu)勢[2]。因而也使許多過去單純正畸難以治療的病例及不能解決的問題得以實現(xiàn)其矯治目的。臨床中MIA種植體脫落問題受到廣泛關(guān)注[2]，但MIA種植體發(fā)生脫落的原因尚不清楚。近年來越來越多的研究表明，口腔菌群失調(diào)與口腔相關(guān)疾病密切相關(guān)，這些微生物在口腔的不同部位共棲、競爭與拮抗，與人類口腔組織器官建立了一種動態(tài)平衡關(guān)系[3]，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍與口腔菌群的改變密切相關(guān)[4]。口腔菌群失調(diào)導(dǎo)致口腔感染的發(fā)生，體現(xiàn)在齲病、牙周炎以及口腔黏膜疾病中[5]。本研究通過分析臨床微型種植體支抗脫落患者的口腔菌群變化，旨在探討微型種植體支抗脫落與口腔菌群的相關(guān)性，通過干預(yù)口腔菌群平衡進而為解決臨床微型種植脫落奠定基礎(chǔ)，針對相關(guān)菌群的研究對維持種植體周圍組織的健康，提高成功率具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2018年8月2019年10月銀川市口腔醫(yī)院正畸科收治的口腔正畸患者，MIA未發(fā)生脫落者為MIA未脫落組(A組)、發(fā)生脫落者為MIA脫落組(B組)、健康志愿者為對照組(C組)，每組30例。納入標準：①患者均無牙周炎與口腔黏膜疾病，無金屬過敏、無全身系統(tǒng)性疾病，口腔衛(wèi)生良好；②植入部位為上頜第一磨牙與第二磨牙之間。排除服用抗菌藥物和激素及未完成治療的患者。所有患者在MIA手術(shù)前均接受口腔衛(wèi)生宣教。治療前征得患者同意，拍攝口腔CBCT及頭顱側(cè)位片。MIA未脫落組男性12例、女性18例，年齡17～25歲；MIA脫落組男性14例、女性16例，年齡16～29歲；對照組男性15例、女性15例，年齡16～26歲?；颊咄夂笤谥橥鈺虾炞?，研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過審查。

1.2 標本采集：各組樣本分別采用1%氯己定含漱1 min，1%碘酊消毒正畸牙冠和周圍牙齦組織，采用無菌刮匙取牙齦溝內(nèi)組織標本，置于含1 mL TE buffer (pH 8.0)的無核酸酶的無菌EP管中，-80 ℃ 凍存用于后續(xù)實時熒光定量PCR的檢測。

1.3 革蘭氏染色：根據(jù)文獻[6]中的方法，采用無菌刮匙取的牙齦溝內(nèi)組織樣本，按照革蘭氏染色的方法制備成染色涂片。油鏡下(10×100)隨機選取分布均勻的6個視野，分別計數(shù)各視野下細菌中革蘭氏陰性桿菌(G-b)、革蘭氏陽性桿菌(G+b)、革蘭氏陽性球菌(G+c)和革蘭氏陰性球菌(G-c)數(shù)量，然后求其均值。

1.4 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測

1.4.1 主要試劑與儀器：采用細菌總DNA提取試劑盒(北京全式金公司產(chǎn)品)提取樣本細菌總DNA。SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒和ABI實時熒光定量PCR儀均為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.4.2 檢測方法：根據(jù)文獻描述[7]方法，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測口腔內(nèi)3種常見的細菌。采用Primer 5.0軟件設(shè)計針對這3種細菌16S rRNA特異性引物序列(表1)，并由上海生工公司合成。將上述試劑盒提取的細菌總DNA，采用特異性引物PCR擴增。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 2 min；PCR反應(yīng)變性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；溶解曲線 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min。以GAPDH為內(nèi)參，每個差異分子分別做3個復(fù)孔，重復(fù)3次試驗。

表1 口腔細菌的引物序列

2 結(jié)果

2.1 牙齦溝液細菌檢出情況比較：經(jīng)過革蘭氏染色口腔細菌微生物計數(shù)發(fā)現(xiàn)，各組樣本中G+c、G-c、G+b、G-b均能檢出(檢出率100%)，提示口腔微生物組成具有多樣性。韋榮球菌、奈瑟菌、放線菌和牙齦卟啉單胞菌在各組間檢出率差異有統(tǒng)計學意義。與對照組對比，MIA未脫落組的韋榮球菌和奈瑟菌檢出率顯著減少(P<0.05)；而與MIA未脫落組相比，MIA脫落組中鏈球菌、韋榮球菌和奈瑟菌檢出率明顯減少(P<0.05)。放線菌和牙齦卟啉單胞菌的檢出情況在對照組和MIA未脫落組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而MIA脫落組中的放線菌和牙齦卟啉單胞菌與MIA未脫落組相比顯著增加(P<0.05)，見表2。

表2 3組患者細菌檢出情況比較[n(%)]

2.2 牙齦溝液細菌分布變化情況：牙齦溝液細菌中G+c、G+b和G-b的微生物計數(shù)在各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與MIA未脫落組相比，MIA脫落組的G-c菌顯著增加(t=5.508，P<0.05)，而MIA未脫落組的G-c菌與對照組相比有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 3組患者口腔微生物計數(shù)比較

對口腔鏈球菌、韋榮球菌、奈瑟菌、放線菌和牙齦卟啉單胞菌進行實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，鏈球菌在各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而MIA脫落組的韋榮球菌和奈瑟菌顯著少于MIA未脫落組(P<0.05)。與MIA未脫落組相比，MIA脫落組的放線菌和牙齦卟啉單胞菌的量增加(P<0.05)。

3 討論

微螺釘支抗種植體或MIA 作為近幾年國內(nèi)外口腔正畸臨床開展的一項新技術(shù)，因其對患者的依存性要求低，手術(shù)簡單、微創(chuàng)，支抗效果顯著等優(yōu)點被廣泛采用。然而，在臨床治療的過程中，MIA種植體脫落問題受到廣泛關(guān)注，其發(fā)生脫落的原因尚不清楚。近年來越來越多的研究表明，細菌感染是導(dǎo)致種植體周圍炎的重要因素之一[8]。這提示口腔細菌破壞可能是MIA脫落的重要影響因素。為此，本研究試圖通過檢測口腔細菌變化，期望解釋可能原因。

口腔菌群是在人類進化進程中口腔常駐微生物，與宿主密切共生，不斷進行物質(zhì)、能量及信息交流的生物群落?；诳谇坏奶厥饨Y(jié)構(gòu)特點，口腔菌群亦呈現(xiàn)出獨特特點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)口腔內(nèi)有750多種不同種類的細菌，在人類口腔微生物數(shù)據(jù)庫(HOMD，www.homd.org)保存了13個門的619種口腔細菌?？谇患毦饕纳陬a黏膜、上頜前庭區(qū)、舌背、舌側(cè)、硬腭、軟腭、牙齒表面、牙齦溝和唾液中[9]，其中牙齦溝和唾液是研究口腔細菌常用的樣本采集部位。有報道證明牙齦溝是一個口腔內(nèi)沉積物的滯留空間，有300多種細菌寄居在其中，多數(shù)為厭氧菌，與牙周健康密切相關(guān)[10]。

本研究中，正畸MIA固定器植入口腔后，容易嵌留各種殘渣及沉積分泌物，如不注意口腔衛(wèi)生，口腔細菌平衡被破壞，致病菌大量增殖，最終可能會導(dǎo)致MIA脫落的發(fā)生。因此，為了分析MIA脫落是否發(fā)生口腔細菌組成的變化，本研究對口腔正畸牙齦溝常見的鏈球菌、韋榮球菌、奈瑟菌、放線菌和牙齦卟啉單胞菌進行了檢測，同時也對口腔中革蘭氏染色及球菌和桿菌進行了微生物計數(shù)分析。本研究發(fā)現(xiàn)口腔G+c、G-c、G+b和G-b均能夠檢出，說明口腔細菌的組成具有顯著的多樣性，這與對口腔細菌的認識是一致的[9]。與此同時，研究顯示韋榮球菌和奈瑟菌在MIA脫落情況下顯著減少。有研究表明，這兩種菌在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中也出現(xiàn)了顯著減少[7]。在另一項研究中，通過細菌計數(shù)發(fā)現(xiàn)口腔鏈球菌、韋榮球菌和奈瑟菌的數(shù)量要低于健康人[11]。但是，本研究中沒有發(fā)現(xiàn)口腔鏈球菌的顯著改變。而在一項正畸治療中也有發(fā)現(xiàn)球菌在治療后顯著降低，這與本研究中發(fā)現(xiàn)的球菌如韋榮球菌和奈瑟菌顯著降低的結(jié)果是一致的[12]。本研究進一步研究細菌組成發(fā)現(xiàn)G-c顯著增加，這提示其可能通過釋放脂多糖(LPS)引發(fā)牙周炎癥的發(fā)生[13]。在本研究中MIA脫落組的放線菌和牙齦卟啉單胞菌顯著減少，說明這兩種菌可能參與了MIA伴隨感染與炎癥的過程。以往研究發(fā)現(xiàn)，放線菌屬是口腔微生物群落的一部分，在調(diào)節(jié)口腔微生物平衡中起重要作用，能夠引起齲齒、根尖周病變等。已有報道牙齦卟啉單胞菌能從口腔感染組織中分離出來，其已被證實是慢性牙周炎的重要病原體，能夠引起牙齦炎、牙周炎、牙髓病和頂端膿腫等口腔疾病[9]。研究發(fā)現(xiàn)在正畸治療后齦溝放線菌和牙齦卟啉單胞菌顯著增加[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)了在口腔正畸MIA脫落中一些重要的口腔細菌的改變，但是由于樣本數(shù)量尚不夠多，在后續(xù)的研究中需要不斷擴大樣本例數(shù)，同時可以采用16S rRNA細菌測序技術(shù)[15]，獲取更加豐富的MIA脫落過程中的菌群組成變化信息，有助于更加全面地認識口腔正畸MIA治療過程中口腔菌群的變化。